海洋烟曲霉源杀锥曲菌素抗副溶血弧菌的活性及其作用机理研究

来源 :江苏海洋大学 | 被引量 : 0次 | 上传用户:lyfwgc2005
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在水产养殖业中,由养殖的动物细菌性疾病带来的经济损失一直是个难题,如副溶血弧菌(Vibrio parahaemolyticus)能够引起鱼、蟹、虾、牡蛎等水产动物死亡,这些情况严重制约了我国水产养殖业的发展。此时通过从丰富的海洋资源中找寻绿色高效的抑菌活性化合物是一个很好的研究方向,其中的海洋真菌则是一个非常好的研究来源。本实验室从海水养殖动物花蚬共生真菌中分离得到的一株烟曲霉Aspergillus fumigatus HX-1,对其发酵培养后通过乙酸乙酯萃取、硅胶柱层析、Sephadex LH-20柱层析、半制备高效液相色谱等方法进行抗菌活性引导分离,获得1个具有抗弧菌活性的化合物—杀锥曲菌素(trypacidin)。本研究通过对烟曲霉HX-1菌株发酵产杀锥曲菌素的工艺条件优化和杀锥曲菌素抗副溶血弧菌的作用机理进行研究,获得如下结果:(1)为了提高烟曲霉Aspergillus fumigatus HX-1菌株发酵得到杀锥曲菌素的产量,首先对HX-1菌株的发酵培养基成分进行了优化筛选,对培养基条件中的碳源、氮源、盐度、无机盐、酸碱度等5个因素进行单因素筛选实验,最终确定培养基成分的条件为:3%麦芽糖、1%牛肉浸膏、5%Na Cl、0.05%Mg SO4、p H为7。(2)在优化培养基成分的基础上,采用二阶段培养法进一步提高杀锥曲菌素的产量,以振荡培养时间,静置培养时间,接种量为主要因素,通过Box-Behnken试验设计法、响应面分析法获得烟曲霉HX-1菌株合成杀锥曲菌素的最优发酵条件为:振荡培养5天,静置培养6天,接种量8%。在该最佳发酵条件下进行多组实验验证,发现杀锥曲菌素的实际产量为20.43±0.56 mg/L,与预测响应面值(21.54 mg/L)无明显差异,说明该工艺优化是可行的。(3)在烟曲霉HX-1菌株发酵培养基中加入糖蜜作为底物,可以促使烟曲霉产生更多的分生孢子,当添加的糖蜜达到60 g/L时,杀锥曲菌素的产量达到了24.06±0.57 mg/L,相较无糖蜜添加组的产量提升了17.7%,表明糖蜜的加入可以提升海洋烟曲霉HX-1菌株的产孢能力和杀锥曲菌素的生物合成能力。(4)杀锥曲菌素对于水产致病副溶血弧菌的活性评价采用了牛津杯法和试管稀释法。通过牛津杯法和试管法测得的活性结果为,杀锥曲菌素对于副溶血弧菌的MIC和MBC分别为31.25μg/m L和62.5μg/m L,阳性对照硫酸链霉素对于副溶血弧菌的MIC和MBC分别为62.5μg/m L和125μg/m L,杀锥曲菌素相较于硫酸链霉素对于副溶血弧菌有着更好的抑制效果。接着通过对细菌的生长、细胞膜的完整性和通透性、细胞壁的通透性和细胞形态等方面来研究杀锥曲菌素抑制副溶血弧菌的作用机理,结果显示杀锥曲菌素作用于副溶血弧菌后会破坏细菌的细胞壁和细胞膜,导致胞内生物大分子如DNA,RNA,蛋白质等物质的泄露,影响了细胞内的核酸,酶,离子的正常代谢,最终导致副溶血弧菌的死亡。同时通过扫描电镜观察杀锥曲菌素对副溶血弧菌菌体超微结构的影响,发现杀锥曲菌素对副溶血弧菌的细胞结构起到了明显的破坏作用。
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