目的:FBXW7（F-box and WD repeat domain-containing protein 7）是泛素-蛋白酶体系统的成员,其可以特异性识别并结合底物蛋白,在蛋白质翻译后泛素化修饰过程中发挥重要的调节作用。前期研究发现,FBXW7在临床肝癌组织中的表达低于癌旁非肿瘤组织,并负向调控肿瘤细胞的侵袭及迁移能力。然而,FBXW7在肝癌干细胞中的表达情况,对肝癌干细胞样生物学特性的影响及潜在的分子机制尚待阐明。本研究计划通过一系列体内外实验方法,探讨FBXW7对肝癌干细胞样生物学特性的分子效应和作用机制,为肝癌的临床诊疗策略的进一步发展提供新的思路。方法:通过细胞无血清悬浮培养法诱导MHCC-97H及Huh7细胞系形成肿瘤球富集肿瘤干细胞,采用RT-q PCR、western blot实验检测FBXW7在肝癌细胞系及肿瘤球中的表达。分别构建FBXW7过表达细胞株及敲减细胞株,通过体内及体外多种功能实验评估FBXW7对肝癌细胞干性生物学特征的影响。采用流式细胞术及免疫荧光分析干性细胞表面标志物CD133的表达,细胞悬浮成球实验检测细胞自我更新能力,裸鼠皮下成瘤实验分析各组细胞的体内致瘤能力,采用药物敏感性试验检测不同处理组细胞对索拉非尼治疗的反应性。通过质谱分析、免疫共沉淀及免疫荧光共定位实验检测FBXW7与靶点ACTL6A的相互作用,采用蛋白质半衰期检测、体内泛素化实验及western blot分析FBXW7对ACTL6A蛋白稳定性及泛素化修饰的调控作用。进一步通过体内及体外功能实验,检测FBXW7调控靶点ACTL6A对肝癌细胞干性表型的影响。结果:与正常肝细胞系LO2相比,FBXW7核酸转录及蛋白表达水平在MHCC-97H、Huh7、Hep G2及HCC-9810等肝癌细胞系中较低;在MHCC-97H和Huh7细胞中,与常规贴壁培养的细胞相比,无血清悬浮培养形成的肿瘤球中FBXW7核酸转录水平及蛋白表达较低。功能实验分析发现FBXW7可在体内及体外抑制肝癌干细胞样生物学特性。过表达FBXW7显著抑制肝癌细胞CD133干性细胞表面标志物的表达、干性相关转录基因的表达、自我更新能力及裸鼠异种移植瘤形成能力,并且FBXW7过表达可增强肝癌细胞对索拉非尼治疗的敏感性;敲低FBXW7的表达后显著增加了肝癌细胞中CD133阳性细胞百分比、干性转录基因的表达、细胞自我更新能力及体内致瘤能力,且对抗癌药物的敏感性显著降低、耐药性增强。从机制上分析,FBXW7作为泛素-蛋白酶体系统特异性的底物蛋白识别分子,可与靶点ACTL6A相互结合并调控其蛋白表达水平。过表达FBXW7后显著抑制了ACTL6A蛋白水平的表达,敲低FBXW7后ACTL6A的表达明显增加。通过蛋白质半衰期检测分析发现,FBXW7可负向调控ACTL6A蛋白的稳定性、促进ACTL6A蛋白的降解。体内泛素化实验证实FBXW7通过泛素-蛋白酶体途径介导靶蛋白ACTL6A的泛素化修饰及降解。功能回复实验进一步表明,FBXW7是通过负向调控ACTL6A的表达发挥其对肝癌细胞自我更新、干性相关基因表达及体内致瘤的抑制效应和对靶向药物索拉非尼的敏感性。结论:FBXW7可调控肝癌干细胞样生物学特性,影响肝癌细胞对抗癌药物索拉非尼的敏感性。机制上,FBXW7可通过泛素-蛋白酶体途径介导ACTL6A的泛素化和降解,发挥其对肝癌干细胞样特性的抑制效应。