【目的】探讨建立体外人脐静脉内皮细胞分离培养方法,为冠状动脉旁路移植术后桥静脉再狭窄机制和治疗的试验研究提供体外血管内皮细胞模型。【方法】取华中科技大学同济医学院附属同济医院新鲜胎儿脐带10条,用0.25%胰蛋白酶灌注消化法对同一根脐带的两段静脉分别消化15min、25min,分离人脐静脉内皮细胞作细胞计数,M199培养基进行原代细胞培养。采用差速贴壁法将成纤维细胞和血液系统细胞分离去除,进行人脐静脉内皮细胞纯化。培养一周后采用免疫组织化学方法检测Ⅷ因子相关抗原vWF因子,进行内皮细胞的鉴定。应用SPSS13.0对消化分离细胞数进行统计学分析,绘制人脐静脉内皮细胞生长曲线。【结果】0.25%胰蛋白酶灌注消化法15min、25min分离的人脐静脉内皮细胞数分别为(11.7±2.47)×105 /ml、(20.5±2.87)×105 /ml,t检验(P<0.05),有统计学意义。差速贴壁法可以去除成纤维细胞和血液系统细胞,纯化脐静脉内皮细胞。2 h左右开始贴壁生长,48h后完全贴壁,15min组细胞成活率高于25min组,72h后可见典型的单层铺路石状排列,一周左右停止增长。免疫组织化学方法检测Ⅷ因子相关抗原vWF因子呈阳性反应。【结论】0.25%胰蛋白酶灌注消化法消化15min可以成功构建体外研究血管内皮细胞模型。