流感,是由流感病毒引起的急性呼吸系统疾病,致病性强、波及范围广、发病率高,是人类生命和财产安全的巨大威胁。近年来,高致病性禽流感不断在全球范围内爆发。其中H7N9流感病毒自2013年首次在国内发现以来,已造成国内上千人死亡,致死率高达39%。流感病毒根据其表面HA和NA的抗原特性,可分为多个亚型。流感病毒在宿主细胞内经过吸附、传入、脱壳、生物合成、装配与释放的过程完成复制,并不断发生抗原性漂移和转变从而躲避宿主的免疫系统。目前应对流感的主要措施包括疫苗接种和药物治疗,由于流感病毒变异性强,疫苗研发存在一定的滞后性,因此抗病毒药物成为应对流感的主要措施。抗流感药物主要包括以下几类:(1)M2离子通道抑制剂(金刚烷胺、金刚乙胺等);(2)RNA聚合酶抑制剂(法匹拉韦等);(3)神经氨酸酶(NA)抑制剂(奥司他韦、扎那米韦、帕拉米韦和拉尼娜米韦等);(4)其它抗病毒药物。本文共四章分两个部分分别阐述了抗病毒药物法匹拉韦的产业化设计与奥司他韦“me-too”药物的研究。第一部分:抗病毒药物法匹拉韦的产业化设计法匹拉韦是新型抗病毒药物,能够选择性抑制流感病毒RNA依赖RNA聚合酶(RdRp),而对宿主细胞DNA和RNA不产生影响,目前已被批准用于治疗新发或复发流感。同时,有研究证实法匹拉韦对其它多种病毒也有效。本文首先对其抗病毒活性进行综述,重点描述其抗流感病毒活性,并对其抗流感病毒的作用机制进行了描述。同时简介了法匹拉韦抗沙粒病毒、布尼亚病毒、黄热病病毒、以及甲病毒、诺如病毒等多种RNA病毒活性。通过文献检索,我们拟定了三条路线,分别以3-氨基吡嗪-2-羧酸、3-羟基吡嗪-2-羧酸、3-氨基吡嗪-2-甲酸三种物料为起始原料合成法匹拉韦,并对各路线的各主要步骤进行描述。通过小试,对各路线涉及的重要反应如重氮化反应、硝化反应、羟基保护反应、氟取代反应进行分析和讨论,确定了各反应的反应条件。通过对三条路线进行对比分析发现,路线1与路线2存在使用昂贵催化剂、溶剂用量大、反应收率低等缺点,不宜作为工业放大路线,而路线3仅一步使用三氯氧磷,反应操作安全要求较高,后处理要求严格外,其余步骤反应条件温和,总收率相对较高,可在优化后作为产业化生产路线。由于路线三涉及六步反应,反应周期较长,车间生产成本大,因此可选择合适的已商业化的中间体缩短路线进行车间生产。通过调研发现,3,6-二氟-2-氰基吡嗪是法匹拉韦的的关键化学片段,且容易获得、运输与储存,同时可采用常用的化学手段进行分析与质量控制。基于以上原因,采用3,6-二氟-2-氰基吡嗪作为合成法匹拉韦的起始物料,缩短生产步骤,同时避免了三氯氧磷的使用。根据3,6-二氟-2-氰基吡嗪的制备工艺路线,以及后继法匹拉韦的合成路线,分析由起始物料引入成品中的杂质,结合多批次物料的实际检测结果,制定了起始物料的质量控制策略以及质量标准。通过对羟基取代、氰基水解、产品精制三个关键工艺步骤进行优化,制定关键工艺参数控制标准。通过反应机理分析反应中可能出现的副产物,探讨各中间产品的工艺杂质,结合实际生产检测结果,制定各步中间产品的质量标准,并对工艺进行优化。所设计的法匹拉韦产业化路线反应步骤少,原料便宜易得,反应温和,操作简单,同时收率由24%提高至50%-60%,所生产的法匹拉韦纯度达98%以上,适合产业化生产。结合CFDA对原料药产业化设计的指导原则,制定了法匹拉韦详细的工艺操作方法、工艺流程图,明确了各步所使用的设备以及相应各步的收率范围。并根据对小试、中试试验数据对放大进行合理评估,拟定商业化投料批量为7.0 kg,预计每批可获得法匹拉韦成品3.0 kg-3.5 kg,可满足工业化生产需求。第二部分:奥司他韦“Me-Too”药物的研究神经氨酸酶(NA),是病毒表面重要的活性糖蛋白,其活性中心由18个氨基酸残基构成。设计一个能与NA活性中心氨基酸残基结合的化合物是NA抑制剂设计的主要思路。目前NA抑制剂主要包括以下几类:唾液酸类、苯甲酸类、环己烯类、环戊烷类、吡咯烷类、以及天然产物类NA抑制剂。目前已上市的NA抑制剂主要包括奥司他韦、扎那米韦、以及帕拉米韦、拉尼娜米韦等。由于NA抑制剂疗效确切,安全性好,耐受性高,是我国治疗流感病毒感染的主要临床用药。当流感病毒NA活性位点附近的形状发生改变时,其与NA抑制剂的结合力下降,流感病毒产生耐药性,导致药物效力降低。目前已发现对多种NA抑制剂耐药的病毒变种。由于耐药病毒株具有高度传染性和致病性,防控难度大,因此,因此需要对已知的NA抑制剂进行结构优化,寻找活性更高、选择性更好的NA抑制剂。2006年曾有报道指出Group-1的NA在其活性中心附近存在一个150-cavity,为NA抑制剂的开发提供了新的思路。我们以奥司他韦为先导化合物,通过对C-5位氨基的结构修饰,引入含有脂肪环或芳香环的环状取代基或含有氨基酸侧链的苯环取代基,合成了 QDZT-1与QDZT-2两系列共16个化合物,并通过1H NMR、13C NMR、高分辨质谱对其进行结构确证。细胞毒性测试结果显示,所有化合物均不具有明显细胞毒性。通过体外CPE实验与MTS实验,发现化合物QDZT-1-03 与化合物 QDZT-2-05 对 H1NlA/Ned/378/05NA 病毒株的 NA 抑制活性最高,其 EC50 分别为 1.3 μM、3.1 μM(CPE 法)和 0.387μM、1.7 μM·(MTS法)。对NA的抑制作用试验显示,化合物QDZT-1-03对NA的抑制作用强于QDZT-2-05,但都弱于阳性对照奥司他韦羧酸盐。通过分子对接发现这两个分子中C-5位的侧链能够占据150-cavity,并与NA的活性中心相结合,其中QDZT-2-05还能够在150-cavity内形成氢键,增加与NA的结合力。通过分子活性测试与分子对接结果,分析推测了化合物产生活性差异的原因,为后续奥司他韦“me-too”药物的设计与合成提供了参考。双前药药物由于能够提高药物效力,逐渐成为药物研发的热门领域。由于抗病毒药物的长期应用,导致病毒产生交叉耐药性,抗病毒药物效力逐渐降低。因此可通过设计针对病毒不同复制周期中不同靶点的双前药药物,以提高药物抗病毒作用,降低药物毒副作用。法匹拉韦与奥司他韦分别为流感病毒RdRp抑制剂与NA抑制剂,已有报道证实二者合用时能够提高抗病毒效果。因此我们设计了一条合成路线,通过甲酸甲酯键将二者连接,合成了基于法匹拉韦与奥司他韦的全新双前药药物QDZT-3-01,以达到提高药效、减小剂量、降低毒副作用的效果。经测试发现,该化合物对H5N2流感病毒感染MDCK细胞存在一定抑制作用。肝微粒体代谢稳定性试验与血浆微粒体代谢稳定性试验结果表明该化合物稳定性较好,具有进一步研究潜力。总结与展望:由于流感病毒不断出现耐药性,导致临床可用的抗病毒药物越来越少,针对新病毒的特异性疫苗的研发存在滞后型,因此急需开发新的抗流感病毒药物。法匹拉韦是流感病毒RdRp抑制剂,被批准用于治疗新发或复发流感。本文通过文献检索,确定了三条可行性路线,并分别进行小试规模的合成。通过试验结果与讨论,结合起始物料的可获得性及成本因素,最终确定产业化工艺路线,并通过逐级放大、有关质量研究和工艺优化,确定了相关各步的工艺参数,以及中间体的质控标准。所选工艺经过车间中试确认,具备工艺可行性。本研究同时对奥司他韦“me-too”药物的设计与合成进行了研究。基于Group-1 NAs结构中特有的150-cavity,对奥司他韦进行结构修饰,在C-5位引入脂肪环或芳香环的环状取代基或含有氨基酸侧链的苯环取代基,合成QDZT-1与QDZT-2系列化合物。通过活性测试与分子对接,进一步揭示了分子活性与150-cavity的关系,为新型NA抑制剂的设计提供了思路与方向。基于双前药设计理念,设计合成了全新的化合物QDZT-3-01,为新型抗流感病毒药物的设计提供了全新的思路。