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第四纪时,全球气候发生了剧烈振荡,并对动植物的地理分布产生重大影响。整个第四纪根据冰川的发育和消退可划分为多个冰期和间冰期。卵叶报春(Primula ovalifolia Franch.)隶属于报春花科报春花属,为多年生草本植物,生长在温带阔叶林下和山谷中。它主要分布在华中地区和邻近的西南山地(四川盆地周围的山脉)。这一带区域在第四纪时曾经经历过大规模的地质构造运动。因此,本论文试图通过对卵叶报春的亲缘地理学研究,探讨第四纪的气候振荡和分布区内的地质构造对生物的影响。此外,卵叶报春的分布区域范围内(主要是华中地区)目前分布有大量的植物种类,尤其是温带物种,是我国种子植物多样性热点地区之一。通过对卵叶报春的遗传多样性和遗传结构的分析,可以为探讨该区域物种多样性的形成机制提供一定的参考价值。本论文研究内容主要分为两个部分:
1、卵叶报春的亲缘地理学研究
本论文通过对叶绿体基因组三个非编码区基因片段的直接测序,来研究卵叶报春的亲缘地理结构。三个叶绿体非编码区基因片段(trnT-L,trnL-F, rps16)的序列整合后,共获得23个不同的cpDNA单倍型。对这23个单倍型和13个卵叶报春居群进行进一步的分析发现:(1)系统发育分析结果表明,晚花卵叶报春(Primula tardiflora C. M. Hu)与卵叶报春具有较近的亲缘关系。本研究结果支持将晚花卵叶报春作为卵叶报春的一个亚种。(2)基于将晚花卵叶报春作为卵叶报春亚种处理的基础上,本研究结果表明,在物种水平上,卵叶报春表现出高水平的遗传多样性(HT=0.987)和强烈的遗传分化(GST=0.784)。AMOVA分析表明遗传分化主要来自于居群间,居群内的遗传分化很小。(3)无论是MP树还是无根网络图,所获得的23个单倍型都聚成三个大支系。这三个大支内部单倍型间的关系没有得到很好的解决,但NST>GST表明卵叶报春具有强烈的亲缘地理结构。结合地理分布信息,三大支系具有很强的地理区域性。(4)失配分布分析和中性检测都表明卵叶报春没有经历过快速扩张。但是巢式分析的结果和BSP分析结果都表明卵叶报春曾经经历过生境的扩张,可能因为这种扩张是缓慢的,失配分布分析和中性检测没有检测到。(5)对卵叶报春现存居群的最近共祖时间进行估算,推测出三大支系之间以及居群之间的分化时间都很早,也由此证明卵叶报春经历了较长的演化历史。卵叶报春的演化贯穿了整个第四纪,而且各支系在分隔后具有各自相对独立的演化历史。缓慢扩张后的生境片断化是当前卵叶报春空间分布格局形成的主要原因。第四纪时的全球气候振荡引起的生境片断化和分布区内的地质构造运动导致居群间强烈的遗传分化。(6)结合卵叶报春古老单倍型的分布、居群遗传多样性和分化时间的估算,推测四川宝兴地区、峨眉地区和湖南桑植地区是卵叶报春早第四纪时的几个主要冰期避难所。在晚第四纪时,由于青藏高原的隆起和秦巴山脉的抬升形成南北自然屏障,使卵叶报春分布区内受全球振荡气候的影响较小,因此卵叶报春各谱系得以稳定的繁殖发展。
2、卵叶报春微卫星位点的开发
本论文采用磁珠富集法构建卵叶报春的微卫星文库。研究结果如下:在所得到的克隆中随机挑选了494个克隆,同时用三对引物,分别为M13F/AG10、M13R/AG10和M13F/M13R,对菌落进行PCR,用1.5%的琼脂糖进行检测。对检测到有两到三条带扩增出来的95个阳性克隆进行测序。从测序结果中发现其中的74条序列含有微卫星位点,但是有相当一部分序列中的微卫星位点靠近序列的两端。这可能是由于富集过程中部分酶切片段过短所致。这些序列由于两侧翼区序列太短而无法设计引物。最终筛选出18条序列进行引物的设计,利用3个卵叶报春自然居群中的24个个体对设计出来的引物进行多态性检测。18对引物中12对能在24个个体中扩增出明显的亮带,其中有1对引物扩增出来的产物为非目的片段,另11对引物经过6%的变性聚丙烯酰胺胶电泳检测后发现有4条微卫星序列具有多态性。本论文是首次在卵叶报春中开发微卫星位点,填补了该物种微卫星序列的空白,也为进一步的遗传多样性和遗传结构的分析奠定了基础。同时,由于微卫星序列在近缘种间的保守性,卵叶报春微卫星位点的开发有望为获得报春花属其他物种的微卫星位点提供一定的参考价值。