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研究背景:不育症已经成为困扰人类健康的三大因素之一,大约影响着全球10-15%的育龄人群。弱畸精子症是男性不育症的主要原因之一,其特征是（1）精子活动力下降;（2）精子头、颈或尾部鞭毛明显的形态异常,从而导致男性不育。2003年首次报道了CATSPER2（MIM:607249）的纯合突变与人类精子活动力和形态异常有关,并可导致男性不育。到目前为止,已经确定了几种导致不同类型弱畸精子症的基因。例如,SUN5（MIM:613942）突变会导致严重的无头精子症。DNAH1（MIM:603332）、CFAP家族成员和一些其他基因的变异可导致人类鞭毛多种形态异常（MMAF）;AURKC突变可导致大头精子症;DYP19L2的突变导致圆形精子症。这些发现表明弱畸精子症具有很强的遗传异质性并有多种表型。与人类精子鞭毛多发形态异常（morphological abnormalities in the sperm flagella,MMAF）相关的弱畸精子症是男性不育的重要原因之一。MMAF表现出明显的遗传异质性,因此可能有许多尚未明确的基因与其发生有关。此前的研究表明,与轴丝及轴丝周围结构、中心体结构以及蛋白质运输系统相关的基因突变均可能导致鞭毛轴丝形成障碍,从而造成人类精子鞭毛多发形态异常综合征。目的:以严重的弱畸精子症伴有MMAF的原发性不育患者为研究对象,通过全外显子测序技术,寻找MMAF相关的弱畸精子症的致病基因,并观察MMAF患者ICSI治疗结局,以期为临床上MMAF患者基因诊断进一步提供遗传咨询,为产前诊断提供理论依据。方法:收集来自安徽医科大学第一附属医院生殖医学中心的3例严重弱畸精子症患者的血样。3名先证者均来自近亲家庭,且互相之间无亲属关系。他们均被诊断为MMAF相关的弱畸精子症,其中一名先证者（AP1）的精子畸形主要表现为无尾、短尾、卷尾、折尾和不规则的尾部,另两名先证者（A029 IV-1和A033 IV-1）的精子畸形主要表现为鞭毛缺失（>90%）。我们对3名患者不育症的发病和进展进行了详细的询问及记录。检查发现他们的男性外生殖器、双侧睾丸大小、第二性征和激素水平均正常。染色体核型均正常（46,XY）,且排除了Y染色体微缺失。此外,我们通过嗅觉测试和计算机断层扫描（CT）成像排除了鼻窦炎、支气管炎、肺炎和中耳炎等原发性纤毛运动障碍（primary cilia dyskinesia,PCD）的相关症状以及其他纤毛疾病,如多囊肾病或Bardet-Biedl综合征等。同时采集患者和其父母的外周血样本进行遗传学分析。我们对3名先证者进行了全外显子测序（whole exome sequencing,WES）,检测出两种新的基因/突变可能是致病原因。基于人体样本的精子免疫荧光实验和实时荧光定量PCR用于检测精子中相应蛋白质和RNA水平的变化。扫描电镜和透射电镜用于观察精子的超微结构的变化。质粒转染细胞后进行免疫荧光和蛋白质印迹实验（western blot,WB）,观察基因突变在体外是否导致蛋白水平的变化。此外,我们还针对其中一个基因构建了小鼠模型,通过观察特定基因突变对小鼠精子形态和功能的影响,进一步证实了该基因突变在人类和小鼠中均可导致MMAF的发生。结果:3名先证者的WES结果显示其中一名先证者（AP1）携带有WDR19的纯合错义突变（c.A3811G,p.K1271E）,另外两名先证者（A029 IV-1和A033 IV-1）携带有DZIP1纯合突变:第一个先证者A029 IV-1携带有一个纯合的错义突变DZIP1 c.188G>A（p.Arg63Gln）,第二个先证者A033 IV-1携带纯合的截短突变DZIP1 c.690T>G（p.Tyr230*）。以上三种突变都没有在人类基因组公共数据库中检测到,也没有在我们自己的875个汉族对照人群的数据中检测到。对于WDR19突变患者,精液分析显示前向运动精子为0,多数精子鞭毛表现为短尾或卷尾。通过扫描电镜和透射电镜观察患者的精子,发现其精子鞭毛的轴丝结构完全破坏,微管结构消失。免疫荧光试验显示WDR19蛋白在其精子鞭毛中消失。此外,多种鞭毛相关蛋白,如IFT88、IFT140和SPAG6等在患者的精子中表达量和细胞定位也发生了变化。对于DZIP1突变患者,两个先证者都表现出严重的MMAF表型,主要表现为90%以上的精子鞭毛缺失。我们在这两个先证者的精子中均可观察到DZIP1蛋白的缺失和异常的中心粒信号。对先证者精子进行中心粒蛋白Centrin1免疫荧光染色,结果显示先证者精子中心体异常,部分表现为中心粒缺失,部分可见两个以上中心粒。构建两种DZIP1突变质粒并转染HEK293T细胞,可见DZIP1表达水平降低或表现为截短蛋白。利用CRISPR-Cas9技术建立的Dzip1敲除小鼠模型显示出与人类一致的严重MMAF表型。结论:（1）WDR19纯合错义突变是一种新的致病基因变异,它可导致弱精子症,并引起男性不育,且不伴有其他的纤毛疾病的症状。此外,WDR19可能与其他鞭毛特异性蛋白协同作用,引起鞭毛微管的紊乱和精子活力严重下降。（2）纯合DZIP1突变可导致严重的MMAF表型的弱畸精子症。DZIP1是精子鞭毛和精子中心粒形成所必需的,缺乏DZIP1蛋白会导致精子中心粒功能障碍,并导致鞭毛缺失,因此DZIP1突变是严重MMAF弱畸精子症的致病因素。