【研究背景及目的】肝细胞癌(Hepatocellular carcinoma，HCC）是世界上最常见的恶性肿瘤之一，其发病率和死亡率均居恶性肿瘤的前列。近年来，虽然不断有新的治疗手段出现，但晚期肝癌的预后未能得到根本改变，临床迫切需要寻找新的治疗方案。肝细胞核因子4α（HNF4α）是一种细胞核激素受体家族的转录因子，在分化成熟的肝细胞中高表达，对肝细胞分化和维护肝细胞生物学功能发挥着重要转录调控作用。本实验室前期研究发现，HNF4α过表达腺病毒感染肝癌细胞株，可使肝癌细胞的肿瘤干细胞标志蛋白（CD90、CD133）下调，肝功能相关基因上调，发生“肝细胞样”改变，肝癌细胞成瘤能力消失。体内研究表明，HNF4α可显著抑制小鼠实验性肝癌生长。HNF4α作为一种作用广泛的核内转录因子，能够被部分miRNA调控的同时，也能够调控一部分miRNA。新近发现miR-629、miR-24可靶向负调控HNF4α表达，从而促进肝癌发生，而HNF4α调控的miR-124可显著抑制肝癌的发生和发展。本实验室前期发现HNF4α能够直接结合于人14号染色体印记基因Dlk1/Dio3区域上位点，对该区域中hsa-miR-379~hsa-miR-656miRNA簇进行转录调控，并且过表达该区域上的miRNAs对肿瘤细胞的增殖、迁移、侵袭均有不同程度的抑制作用。miR-134是该区域中一个miRNAs。基于以上研究背景和前期实验结果，本课题首先分析miR-134在肝癌组织的表达及其与肝癌患者临床恶性表型和预后的相关性，并探讨miR-134对肝癌细胞的作用及其机制，为肝癌的诊治提供新的靶点。【实验方法】一、miR-134在肝癌组织中的变化及其临床意义1.腹腔注射二乙基亚硝胺（diethylinitrosamine，DEN）制备大鼠肝癌模型。分别取正常、11周、14周、17周、19周大鼠肝组织，用Real-time PCR的方法检测DEN造模大鼠肝脏组织中HNF4α及miR-134前前体（primary miR-134；pri-miR-134）的表达，并对两者的表达相关性进行分析。2.利用Real-time PCR检测临床标本中肝癌/癌旁组织中pri-miR-134及HNF4α的差异表达，分析两者表达的相关性，并从肿瘤大小、肝癌临床分期、AFP、生存期等方面分析miR-134在肝癌组织中表达变化的临床意义。二、miR-134抑制肝癌细胞生物学特性1.利用化学合成的miR-134拟似物（miR-134mimic）上调肝癌细胞株YY-8103及LM3细胞中miR-134表达，或利用2′-甲氧修饰的miR-134互补链（as-miR-134）抑制肝癌细胞株miR-134的作用，通过CCK8（cell counting kit-8）检测miR-134对肝癌细胞增殖能力的影响。2. YY-8103及LM3细胞转染miR-134mimic或as-miR-134后，观察miR-134对肿瘤细胞在软琼脂培养基中克隆形成能力的影响。3. YY-8103及LM3细胞转染miR-134mimic或as-miR-134后，通过细胞迁移、侵袭实验观察miR-134对肝癌细胞迁移、侵袭能力的影响。4. YY-8103细胞转染miR-134mimic后，检测细胞周期及细胞凋亡。5. miR-134对肝癌细胞成瘤性的影响分别将感染表达miR-134的腺病毒（Ad-miR-134）及对照病毒（Ad-GFP）的肝癌细胞YY-8103、LM3接种于裸鼠两侧腋窝皮下，定期观察肿瘤生长情况并测量大小，观察miR-134对肝癌细胞成瘤性的影响。6. miR-134对裸鼠皮下种植瘤生长的影响在裸鼠两侧腋窝皮下注射LM3细胞，每侧2×10~6个细胞，待肿瘤长至50mm~3时（约10天），瘤内注射Ad-miR-134或Ad-GFP（2×10~9pfu），每周2次，观察肿瘤生长情况并测量肿瘤大小。3周左右处死裸鼠，取肿瘤组织称重，测量大小，抽提组织RNA，Real-time PCR法检测两侧肿瘤中miR-134的差异表达，免疫组织化学法检测两侧肿瘤中Ki67及靶基因的表达情况，综合评估上调miR-134表达对裸鼠皮下种植瘤模型的治疗效果。三、确定miR-134的靶基因通过targetscan预测miR-134靶基因，在YY-8103肝癌细胞中转染miR-134mimic或as-miR-134，通过Western Blot和Real-time PCR验证miR-134的靶基因。进一步利用含有靶基因3’UTR的报告基因载体证实miR-134对其靶基因。共转染不含3’UTR的靶基因过表达质粒及miR-134mimic检测YY-8103的增殖能力、软琼脂克隆形成能力、迁移及侵袭能力的变化，确定miR-134是否通过该靶基因发挥其生物学效应。四、miR-134在HNF4α抑制肝癌过程中的作用YY-8103细胞株感染HNF4α病毒上调HNF4α的同时，转染as-miR-134下调miR-134，检测肝癌细胞增殖、软琼脂克隆形成能力、迁移及侵袭能力的变化，并利用RT-PCR和Western Blot检测miR-134靶基因mRNA及蛋白水平。五、统计学分析数据采用SPSS16.0统计软件包进行分析。方差齐性两样本资料采用两样本双尾T检验；方差不齐的配对资料采用Wilcoxon符号秩检验；方差不齐的不配对资料采用Mann-Whitney U检验；四格表资料采用χ2检验；生存分析采用Kaplan-Meier分析；生存曲线采用log-rank检验；P <0.05为具有统计学差异。【实验结果】一、miR-134在肝癌组织中的变化及其临床意义检测DEN诱发的大鼠实验性肝癌模型不同时间点肝组织中HNF4α及pri-miR-134的表达变化，发现随着造模时间的延长，肝脏HNF4α及pri-miR-134表达下调，并且HNF4α与pri-miR-134的表达变化呈线性相关。在71例临床标本中，有63%（45/71）肝癌组织中HNF4α表达较癌旁组织下降，70%（50/71）肝癌组织中pri-miR-134表达下调。与HNF4α表达不下调的病例相比，在HNF4α表达下调的病例中pri-miR-134表达降低的更多，（HNF4α-low89%:HNF4α-high38%，P <0.001），而且肿瘤组织pri-miR-134高表达的病例较pri-miR-134低表达的病例，肿瘤更小，合并肝硬化的比率小，处于TNM I-II期的比例高，有包膜包裹的病例数多（χ~2检验，P <0.05）。二、miR-134抑制肝癌细胞生物学特性及其机制1. miR-134能够抑制肿瘤生物学特性（1）miR-134抑制人肝癌细胞株增殖能力miR-134可降低肝癌细胞株YY-8103及LM3的增殖能力，而抑制miR-134作用可显著促进肝癌细胞株的增殖。（2）miR-134抑制人肝癌细胞株软琼脂克隆形成能力miR-134可以显著抑制YY-8103及LM3细胞的软琼脂克隆形成能力，抑制率约为70%；反之，转染as-miR-134后，肝癌细胞的克隆形成能力相比对照组明显增强，最高可达1.5倍。（3）miR-134抑制人肝癌细胞迁移及侵袭能力YY-8103及LM3细胞转染miR-134mimic后，细胞的迁移及侵袭能力受到抑制；而转染as-miR-134后，肝癌细胞的迁移、侵袭能力明显增强。（4）miR-134可使YY-8103细胞周期阻滞在G2/M期YY-8103中转染miR-134mimic48小时后流式细胞仪检测细胞周期，结果显示，相比对照组，miR-134能够将细胞阻滞在G2/M期（117%，P <0.01）。同时，AnnexinV-EGFP/PI双染检测细胞凋亡，miR-134组与对照组无统计学差异。（5）miR-134能够显著抑制肝癌细胞的皮下成瘤能力皮下成瘤实验结果显示：YY-8103细胞感染AdGFP/AdmiR-134后接种于裸鼠皮下，18天时AdGFP组10只（100%）可触及肿瘤，而18天时AdmiR-134组只有3只（30%）小鼠可触及肿瘤生长，且肿瘤较AdGFP侧小。LM3-AdGFP组接种11天后8只（80%）皮下可触及肿瘤，19天后10只（100%）小鼠可触及肿瘤生长，然而，AdmiR-134感染的LM3细胞接种10天后仅1只（10%）出现皮下肿瘤，25天时6只（60%）触及皮下肿瘤，且相比AdGFP组，AdmiR-134组肿瘤体积较小。（6）miR-134抑制肝癌皮下种植瘤生长通过瘤内注射AdmiR-134/AdGFP，发现：在每个测量时间点Ad-miR-134注射组肿瘤体积均明显小于Ad-GFP注射组。处死老鼠后取出肿瘤，Ad-miR-134组肿瘤重量显著轻于对照组。Real-time PCR结果显示，与对照侧相比，注射Ad-miR-134的肿瘤miR-134表达均有不同程度升高，免疫组化结果显示AdmiR-134组增殖相关抗原Ki67阳性细胞比例减少。2. KRAS是miR-134的直接靶基因（1）在不同肝癌细胞株中，miR-134能够下调KRAS mRNA及蛋白水平；而as-miR-134能够上调KRAS mRNA及蛋白水平；（2）荧光素酶报告基因提示miR-134能够下调KRAS3’UTR报告基因质粒表达，而突变KRAS3’UTR上结合位点则无法下调荧光素酶表达；（3）皮下种植瘤注射AdmiR-134组肿瘤相比对照组肿瘤，KRAS表达明显降低。3. miR-134通过下调靶基因发挥其生物学功能过表达KRAS能够减弱miR-134对YY-8103肝癌细胞的增殖、软琼脂克隆形成能力及细胞迁移、侵袭能力的抑制作用。4. HNF4α通过上调miR-134逆转肿瘤恶性进展as-miR-134能够轻微下调HNF4α对YY-8103的增殖抑制作用，显著降低HNF4α对肿瘤细胞软琼脂克隆形成能力、迁移和侵袭能力的抑制作用。此外，下调miR-134表达可抑制HNF4α对KRAS基因及蛋白表达的作用。【结论】1.肝癌组织中miR-134表达与HNF4α呈显著正相关，且与肝癌临床恶性表型密切相关。2. miR-134显著抑制肝癌细胞增殖、克隆形成和转移能力。3.原癌基因KRAS是miR-134的直接靶基因。4. HNF4α部分通过上调miR-134发挥其抗肿瘤作用。