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近年研究表明,血管平滑肌细胞(Vascular smooth muscle cell,VSMC)的异常增殖和迁移是动脉粥样硬化和血管成形术后再狭窄等血管重塑性疾病的病理学基础。VSMC表型转化是其异常增殖和迁移的先决条件。VSMC表型可分为分化程度较高的收缩型(分化型)和分化程度较低的合成型(去分化型或增殖型)。在高糖、高脂、血流剪切应力等血管损伤因素的作用下,收缩型VSMC转化为合成型,并进行增殖、迁移和大量合成与分泌细胞外基质,导致动脉粥样硬化斑块和血管新生内膜形成。Krüppel样因子4(KLF4)是一种含有锌指结构的转录因子,通过调控启动子区富含GC/GT序列的基因表达而在细胞生长、增殖、分化和凋亡中发挥重要作用。在心血管系统,血管内皮细胞、VSMC和巨噬细胞中均表达KLF4,其表达受剪切应力、转化生长因子β(TGF-β)、血小板衍生生长因子BB(PDGF-BB)的调节,参与心血管疾病的发生发展过程。血小板衍生生长因子(PDGF)是由多种细胞合成并释放的多肽类生长因子,能刺激VSMC、成纤维细胞等多种细胞的增殖。在血管损伤或炎症因子刺激下,VSMC、巨噬细胞、血小板、浸润的炎性细胞、受损的内皮细胞均可以分泌PDGF。PDGF以自分泌、旁分泌的方式作用于VSMC,促进VSMC表型转化及异常增殖。环状RNA(circ RNA)是一类由m RNA前体(Pre-m RNA)经反向剪接形成的共价闭合环状非编码RNA。目前已经在人体中鉴定出了很多种circ RNA,其中许多以组织特异性或疾病特异性方式表达。虽然大多数circ RNA的生物学功能仍然未知,但越来越多的研究结果表明,circ RNA可以通过吸附micro RNA、与RNA结合蛋白相互作用来调控基因的表达,甚至有些circ RNA可以翻译产生多肽。一些研究结果显示,circ RNA参与心血管疾病的发生发展过程。我们实验室前期发现,circ ACTA2通过吸附mi R-548f-5p,解除mi R-548f-5p对α-肌动蛋白基因表达的阻抑而上调α-肌动蛋白表达水平。然而,KLF4和PDGF对VSMC表型以及增殖和分化的调节是否与其诱导形成的circ RNA有关目前尚未见报道。目的:研究KLF4诱导形成的环状RNA circ FAM53B-1/2在PDGF-BB抑制VSMC分化中的作用及相关机制。方法:1.用KLF4腺病毒表达载体(Ad-KLF4)感染体外培养的人血管平滑肌细胞(HVSMC),进行circ RNA芯片分析,通过对比分析在KLF4过表达与对照细胞中的差异表达,筛选受KLF4调控的circ RNA,并用实时定量聚合酶链式反应(PCR)进行验证。2.用不同浓度PDGF-BB处理VSMC不同时间,来确定PDGF-BB诱导VSMC增殖的最适浓度和作用时间。实时定量PCR(q RT-PCR)检测分析KLF4、circ FAM53B-1和circ FAM53B-2 m RNA的表达水平;Western blot检测分析KLF4蛋白水平。用Ad-KLF4感染VSMC 24 h后,再给予PDGF-BB(10 ng/m L)刺激,收集细胞,q RT-PCR检测分析circ FAM53B-1和circ FAM53B-2的表达。3.构建circ FAM53B-1和circ FAM53B-2表达载体并用其转染VSMC,24h后,收集细胞,用real-time PCR检测两种circ RNA的表达;用Western blot分析检测VSMC分化标志基因平滑肌肌动蛋白(SMA)和平滑肌蛋白22α(SM22α)的表达。4.用circ FAM53B-1和circ FAM53B-2表达载体转染VSMC,在VSMC中过表达circ FAM53B-1和circ FAM53B-2,用Western blot检测血清应答因子(SRF)和心肌素(Myocardin)表达。结果:1.circ FAM53B-1和circ FAM53B-2在VSMC中进行表达。选取circ RNA芯片结果中被KLF4上调的31个circ RNA(fold change>4)进行real-time PCR验证,结果发现,有20个circ RNA被KLF4明显上调。我们选取其中的circ FAM53B-1和circ FAM53B-2两个circ RNA进行琼脂糖凝胶电泳鉴定和sanger测序,结果表明,这两个circ RNA的分子量和核苷酸序列都是正确的。2.在VSMC中,KLF4上调circ FAM53B-1和circ FAM53B-2的表达。用Ad-KLF4感染VSMC后,检测circ FAM53B-1和circ FAM53B-2的表达水平。Real-time PCR结果显示,KLF4显著诱导这两种circ RNA的形成。同时,KLF4也显著促进FAM53B线性m RNA表达。3.PDGF-BB通过上调KLF4表达而促进circ FAM53B-1和circ FAM53B-2的形成。用10 ng/m L PDGF-BB刺激VSMC不同时间,以及用不同浓度PDGF-BB刺激VSMC 24 h后,q RT-PCR和Western blot结果显示,PDGF-BB以浓度和时间依赖的方式来促进KLF4表达;同时,以时间依赖的方式上调circ FAM53B-1和circ FAM53B-2表达。更重要的是,当VSMC被Ad-KLF4感染12 h后再给予PDGF-BB刺激时,circ FAM53B-1和circ FAM53B-2的表达水平显著高于转染空载体的细胞,表明PDGF-BB通过诱导KLF4表达而促进circ FAM53B-1和circ FAM53B-2的形成。4.circ FAM53B-1和circ FAM53B-2通过抑制SRF表达下调VSMC分化标志基因SMA和SM22α表达,进而抑制VSMC分化。用circ FAM53B-1和circ FAM53B-2表达载体感染VSMC,在经real-time PCR证实两种circ RNA在VSMC中得到成功表达的基础上,用Western blot检测VSMC分化标志基因SMA和SM22α表达。结果显示,circ FAM53B-1或circ FAM53B-2过表达显著下调SMA和SM22α表达水平。因为VSMC分化标志基因表达受SRF的调节,我们进一步检查circ FAM53B-1和circ FAM53B-2过表达对SRF表达的影响。Western blot结果显示,在VSMC中过表达circ FAM53B-1和circ FAM53B-2显著抑制SRF的表达。这些结果表明,circ FAM53B-1和circ FAM53B-2是通过抑制转录因子SRF表达而抑制VSMC的分化。结论:1.在VSMC中,KLF4上调circ FAM53B-1和circ FAM53B-2的表达。2.PDGF-BB通过上调KLF4表达而促进circ FAM53B-1和circ FAM53B-2的形成。3.circ FAM53B-1和circ FAM53B-2通过抑制SRF表达而下调VSMC分化标志基因SMA和SM22α表达,进而抑制VSMC的分化。