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目的:(1)探讨活血化瘀法是治疗肾纤维化根本方法的中医理论依据;(2)观察具有活血化瘀作用的抗纤灵方在改善慢性肾衰模型小鼠肾功能、脂质代谢及肾纤维化作用;(3)通过mTOR信号通路探讨抗纤灵方治疗肾纤维化的作用机制,为该方临床治疗肾纤维化提供实验依据,为中医药多靶点治疗提供理论依据。 方法:理论研究:(1)通过对祖国医学对肾纤维化病因病机认识、现代名医治疗肾纤维化的学术思想进行整理和总结及目前中医药在治疗肾纤维化临床及动物实验的经验总结,评价活血化瘀法在肾纤维化治疗中的地位;(2)通过对mTOR信号通路的介绍及抗纤灵方前期实验总结,评价抗纤灵方多靶点治疗肾纤维化重要性。实验研究:(1)按platt法建立5/6肾切除小鼠慢性肾衰模型,术后2周眼眶采血,检测血肌酐。按肌酐水平分为假手术组,模型组,抗纤灵低剂量组,抗纤灵中剂量组,抗纤灵高剂量组,雷帕霉素组,使各组之间肌酐值无差别,(p>0.05)。抗纤灵低、中、高剂量组分别给予药物浓度为1g/100g、2g/100g、4g/100g(小鼠体重)灌胃,雷帕霉素组给予药物浓度为0.016mg/100g(小鼠体重)灌胃,假手术组和模型组均给予等量生理盐水灌胃,每天灌胃0.5ml,总疗程12周。分别在4周末、8周末、12周末检测肾功能:Scr、BUN,24hUpr,血脂:TC、TG、LDL、HDL;免疫荧光法测定肾组织Col-Ⅰ、Col-Ⅲ表达水平;Western blot法检测肾组织Col-Ⅰ、Col-Ⅲ、FN、TGF-β1、MMP2、TIMP1、a-SMA蛋白表达水平;采用实时荧光定量PCR法检测肾组织中PI3K,AKT,mTOR,P70S6K基因表达水平。取肾脏组织进行HE、Masson染色,观察其病理变化。 结果:理论研究:(1)肾纤维化基本病机为肾虚血瘀,且“瘀”贯穿本病始终。(2)mTOR信号旁路与肾纤维化发生发展密切相关。(3)抗纤灵方前期有较好实验基础。实验研究:(1)组间比较:在4周末、8周末、12周末,与假手术相比,模型组各项指标均有明显升高或降低(P<0.01);与模型组比较,各治疗组血清Scr、BUN、24hUpr、TC、TG、LDL,肾组织Col-Ⅰ、Col-Ⅲ、FN、TGF-β1、MMP2、TIMP1、a-SMA、PI3KmRNA、AKTmRNA、mTORmRNA、P70S6KmRNA水平均有下降,HDL升高,(P<0.05);与抗纤灵低剂量组比较,抗纤灵中剂量组上述指标均有下降或升高,(P<0.05),抗纤灵高剂量组上述指标明显下降或或升高,(P<0.01);抗纤灵中剂量与高剂量比较时,高剂量组上述指标均有下降或升高,(P<0.05)。在4周末、8周末、12周末,HE、Masson、免疫荧光染色,各治疗组与模型组比较均有改善(P<0.05);抗纤灵三个不同剂量组相互比较时,抗纤灵高剂量组上述病理改善最明显。(2)组内比较:与4周末比较,8周末抗纤灵低、中、高剂量组Scr、BUN、24hUpr、TC、TG、LDL,肾组织Col-Ⅰ、Col-Ⅲ、FN、TGF-β1、MMP2、TIMP1、a-SMA、PI3KmRNA、AKTmRNA、mTORmRNA、P70S6KmRNA水平均有下降,HDL升高(P<0.05),12周末上述指标均明显下降或升高(P<0.01);与8周末比较,12周末上述指标均有下降或升高(P<0.05)。HE、Masson、免疫荧光染色,与4周末比较,8周末有改善(P<0.05),12周末改善明显(P<0.01);与8周末比较,12周末病理有改变(P<0.05)。 结论:理论研究:(1)活血化瘀法是治疗肾纤维化的根本方法。(2)对mTOR信号通路抑制可能延缓肾纤维化进展。(3)抗纤灵方通过多靶点治疗肾纤维化。实验研究:(1)抗纤灵方能明显改善慢性肾衰模型小鼠的血清肌酐、尿素氮及24小时尿蛋白定量水平,保护肾脏功能,延缓慢性肾功能衰竭的进展。(2)抗纤灵方能明显改善慢性肾衰小鼠血清TC、TG、LDL、HDL水平,有效干预脂质代谢紊乱而延缓慢性肾功能衰竭的进展。(3)抗纤灵方能明显降低慢性肾衰小鼠肾组织Col-Ⅰ、Col-Ⅲ、FN、MMP2、TIMP1、α-SMA及TGF-β1等纤维化指标的表达,对抗肾纤维化的进程。(4)抗纤灵方能降低肾脏组织中PI3KmRNA、AKTmRNA、mTORmRNA、P70S6KmRNA表达,因此抗纤灵方抗肾纤维化作用机理可能与抑制mTOR信号通路转导相关(5)抗纤灵方高剂量组优于中、低剂量组,12周末疗效优于4周末、8周末,抗纤灵方在治疗过程中可能存在时间剂量效应关系。(6)具有活血化瘀作用抗纤灵方在中医治疗肾纤维化中具有重要的地位和应用价值。