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目的:凭借其独特的性质和功能,纳米银(Silvernanoparticles,AgNPs)逐渐成为应用最广泛的金属纳米材料之一并存在于各类消费品中,而这可能导致一般人群的累积接触量达到潜在的危险水平。由于关于AgNPs危害人体健康的流行病学调查较少,因此迫切需要评估其潜在的毒性效应,特别是在大脑等敏感组织和器官中。毒理学研究表明,AgNPs可穿过血脑屏障(Blood-brainbarrier,BBB)进入脑组织,进而损伤神经认知和运动功能。近年来,铁死亡,一种以脂质过氧化为特征的铁依赖性细胞死亡方式,被证实可能参与调控神经退行性病变,但具体作用机制仍需探讨。因此,本研究拟通过建立AgNPs染毒及铁死亡抑制剂-1(Ferrostatin-1,Fer-1)或去铁胺甲磺酸盐(Deferoxamine,DFO)干预细胞和动物模型,研究AgNPs对铁死亡信号通路关键指标的影响,探讨铁死亡在AgNPs致神经认知功能损伤中的作用及相关机制。方法:(1)建立AgNPs染毒小鼠海马神经元(Murine hippocampus neuro,HT22)细胞模型:将处于对数生长期的细胞均匀铺种在96或6孔板中并分为四个组,分别是空白对照组、20 μg/mL、40 μg/mL及60 μg/mLAgNPs染毒组。24 h后,加入相应浓度的染毒液再继续培养24h,待染毒结束后收取细胞进行后续相关实验。(2)建立AgNPs染毒及DFO干预动物模型:将40只6-8周龄BALB/c雄性小鼠随机分成对照组、单独DFO干预组、单独AgNPs染毒组及AgNPs+DFO联合处理组四组,其中DFO干预剂量设置为100mg/kg,AgNPs干预剂量设置为4 mg/kg,且DFO干预24 h后行AgNPs暴露,每周鼻腔滴注两次,连续12周。染毒结束后开展Morris水迷宫实验(Morris water maze,MWM),最后收取小鼠血清、海马和皮质组织进行后续相关指标的检测。(3)建立AgNPs染毒及DFO/Fer-1干预HT22细胞模型:参照前期实验结果选择毒性效应最明显的60μg/mL AgNPs浓度进行实验。将处于对数生长期细胞消化重悬并均匀铺种于96或6孔板中,设置空白对照组、0.1 μM DFO、0.1 μM Fer-1干预组、60μg/mL AgNPs染毒组及AgNPs+DFO联合处理组,AgNPs+Fer-1联合处理组。24h后,更换成相应浓度的染毒液或DFO/Fer-1干预液,其中联合处理组是将DFO或Fer-1与AgNPs染毒液共培养24h,染毒结束后收集细胞进行后续实验。(4)采用细胞计数试剂盒-8(Cell counting kit-8,CCK-8)检测 AgNPs 暴露及 DFO/Fer-1 干预对HT22细胞存活率的影响。(5)通过Western blot和实时荧光定量聚合酶链式反应(Real-time Quantitative polymerase chain reaction,RT-PCR)方法检测 β-淀粉样蛋白(Amyloid β-protein,Aβ)生成关键蛋白和基因、铁离子通道相关蛋白和基因及氧化损伤相关蛋白的变化。(6)采用谷胱甘肽过氧化物酶(Glutathione peroxidase,GPX)检测试剂盒、超氧化物歧化酶(Superoxide dismutase,SOD)检测试剂盒、还原型谷胱甘肽(Glutathione,GSH)/氧化型谷胱甘肽(Glutathione,GSSG)-GloTM检测试剂盒、丙二醛(Malondialdehyde,MDA)检测试剂盒及组织或血清铁检测试剂盒分别检测GPX、SOD活性、GSH/GSSG 比率、MDA及细胞或血清铁含量。(7)通过MWM实验观察小鼠空间学习记忆能力的改变。(8)采用苏木精-伊红染色法(Hematoxylin-eosinstaining,HE)观察海马组织病理损伤情况。结果:(1)CCK-8结果显示,HT22细胞存活率随AgNPs浓度的增加呈剂量依赖性下降。蛋白和基因分析结果显示,AgNPs染毒24 h后,HT22细胞中Aβ生成关键蛋白和基因均发生不同程度的变化。与对照组相比,60μg/mLAgNPs染毒组中淀粉样前体蛋白(Amyloid precursorprotein,APP)水平明显增加(P<0.01),而不同剂量AgNPs处理均能显著提高Aβ及β-位点APP裂解酶1(β-site APP cleavingenzyme-1,BACE1)蛋白表达(P<0.01);与抑制Aβ生成相关的去整合蛋白和金属蛋白水解酶 10(A disintegrin and metalloprotease 10,ADAM 10)的蛋白表达水平在40 μg/mL和60 μg/mLAgNPs染毒细胞中明显降低(P<0.01),而基因表达水平则在20 μg/mL AgNPs染毒细胞中下降幅度最大(P<0.01)。与铁死亡密切相关的细胞内铁离子含量及铁离子通道关键基因的表达结果显示,不同剂量的AgNPs均能诱导细胞内铁含量增加(P<0.05),这可能与负责转铁入细胞的转铁蛋白受体1(Transferrin receptor 1,TfR1)和承担转铁出细胞的膜铁转运蛋白1(Ferroportin 1,FPN1)基因表达水平升高而引起的铁代谢紊乱有关(P<0.01)。铁自噬关键蛋白结果显示,在AgNPs作用下,自噬相关蛋白5(Autophagy related protein 5,Atg5)、Beclin-1 及核受体辅激活因子 4(Nuclear receptor coactivator 4,NCOA4)蛋白表达均明显升高(P<0.01),而储存游离铁的铁蛋白重链1(Ferritin heavy chain,FTH1)蛋白水平显著降低(P<0.01)。LC3B蛋白作为监测自噬通量的标志性蛋白,其水平仅在60μg/mLAgNPs染毒组明显低于对照组。随即,我们检测了可能标示铁死亡发生的GPX4蛋白及MDA含量等氧化损伤相关蛋白和指标。结果发现,相比于对照组,不同剂量AgNPs均可降低GPX4蛋白或GPX活性、GSH/GSSG 比率及SOD活性,而MDA含量仅在60 μg/mLAgNPs染毒组显著升高(P<0.01)。在体内发挥抗氧化作用的转录因子核因子红血球-2相关因子 2(Nuclear factor erythroid-2 related factor 2,Nrf2)和血红素氧合酶 1(Heme oxygenase-1,HO-1)蛋白则在不同剂量AgNPs作用下均呈现明显的升高趋势(P<0.01)。以上结果提示我们,AgNPs可能通过激活铁自噬释放游离铁、诱导氧化应激及脂质过氧化作用,进而促进HT22细胞内Aβ沉积、降低细胞存活率并诱发一系列细胞毒性效应。(2)定位航行实验结果发现,在各组小鼠游泳速度无显著差异的情况下,单独AgNPs染毒小鼠训练5天中的每日平均总游程变化均明显大于对照组(P<0.01),且相比于对照组来说,其运动路径相对复杂,轨迹明显弯曲变长,杂乱无章;经铁死亡抑制剂DFO干预后,小鼠前三天定位航行训练中的每日平均总游程变化明显小于单独AgNPs染毒小鼠(P<0.01)。撤掉平台后的空间探索实验结果显示,单独AgNPs染毒小鼠在目标象限里的停留时间及游程均少于对照组(P<0.01);同样DFO干预可明显增加小鼠在目标象限的游程(P<0.01),但对停留时间无明显延长作用(P>0.05)。海马组织病理切片结果表明,AgNPs暴露可损伤小鼠海马组织,可见结构变薄、神经锥体细胞松散,且核固缩深染;DFO+AgNPs联合处理组小鼠海马结构损伤得到明显改善,包括结构变厚、细胞排列紧密整齐。皮质组织病理切片结果显示,AgNPs染毒组可见明显的细胞形态学的改变,细胞排列紊乱并出现空泡状,核仁不规则、固缩深染;DFO+AgNPs联合染毒组小鼠皮质组织病理损伤有所改善,表现为细胞排列相对整齐,核仁规则明显,但仍存在空泡状。随后我们又发现AgNPs暴露可促进海马及皮质组织中 Aβ 沉积、下调突触后致密蛋白-95(Postsynaptic density protein95,PSD95)及脑源性神经营养因子(Brain-derived neurotrophic factor,BDNF)蛋白水平;DFO干预可适当下调或上调上述蛋白水平。综合以上结果,我们推测铁死亡抑制剂DFO可通过抑制Aβ沉积、增加突触可塑性,从而在AgNPs诱导的小鼠神经认知功能损伤中发挥一定的神经保护作用。(3)为了探讨AgNPs是否诱导HT22细胞发生铁死亡及可能的作用机制,我们在Fer-1/DFO干预细胞和DFO干预动物模型中检测了细胞和血清中铁含量、GPX活性和MDA水平。细胞研究结果发现,DFO或Fer-1干预均可改善AgNPs所致细胞内铁含量升高及GPX活性的降低(P<0.01)。此外,我们发现DFO干预动物模型的血清和皮质组织中铁含量和二价金属离子转运体(Divalent metal-ion transporter-1,DMT1)基因表达水平的明显降低、GPX 活性的明显升高以及MDA浓度的显著下降(P<0.01)。然而,DFO干预对GPX4蛋白上游的Nrf2/HO-1蛋白表达无显著影响(P>0.05)。最后,我们在Fer-1/DFO干预细胞模型中发现,Fer-1和DFO均能有效挽救由AgNPs诱导的细胞死亡。以上结果提示我们,AgNPs可能通过提高细胞铁含量和抑制GSH/GPX4信号通路而诱导细胞氧化应激和脂质过氧化损伤,最终启动HT22细胞铁死亡进程。结论:(1)AgNPs暴露可通过激活铁自噬、上调铁离子通道关键基因水平而增加细胞内铁含量,改变氧化应激相关指标及Nrf2-HO-1/GPX4蛋白表达和促进Aβ生成等方式诱导HT22细胞毒性作用;(2)AgNPs暴露可促进Aβ沉积、降低突触可塑性,改变海马及皮质结构并损伤小鼠的学习记忆能力等神经认知功能,而神经细胞铁死亡可能参与其中;(3)通过Fer-1/DFO调控HT-22细胞及动物模型中铁死亡关键信号分子,我们发现,AgNPs可能以铁依赖性方式抑制GSH/GPX4信号通路启动HT22细胞铁死亡进程。