目的：　　通过观察线粒体ATP敏感性钾通道（mitochondrial ATP-sensitive K+channels, mitoKATP通道）开放剂二氮嗪（Diazoxide, DZX）、mitoKATP通道抑制剂格列苯脲（Glibenclamide, GLI）及细胞骨架解聚剂细胞松驰素B（Cytochalasin B, CB）干预措施对体外培养的神经元细胞缺氧损伤后神经细胞形态、细胞凋亡率、丝状肌动蛋白（F-actin）水平、细胞内Ca2+浓度以及Caspase-3水平的影响作用，探讨mitoKATP通道开放剂二氮嗪通过稳定细胞骨架蛋白F-actin起保护缺氧损伤神经细胞的作用及其可能的机制，为临床上开发mitoKATP通道开放剂治疗新生儿缺氧缺血性脑病（hypoxic ischemic encephalopathy, HIE）提供实验依据。　　材料与方法：　　离体培养7-11d SD大鼠皮质神经元分为第一组对照组，正常培养细胞未经任何处理，第二组缺氧后药物干预组，分别为缺氧组、二氮嗪组（DZX300uM）、格列本脲组（DZX300uM/GLI50uM）、细胞松弛素组（DZX300uM/CB5uM），第二组均加有溶剂NaOH，缺氧培养条件为无糖DMEM、95％N2/5%CO2、37℃培养1h，然后恢复维持培养基给予相应药物干预在95%空气/5%CO2、37℃培养箱中继续培养12h，通过倒置相差显微镜观察神经元形态变化，流式细胞仪检测神经元细胞凋亡率，免疫荧光化学测量神经元细胞内Ca2+浓度，免疫细胞化学检测神经元细胞caspase-3的水平，免疫荧光化学方法观察细胞骨架F-actin的水平及形态变化。实验结果均以均数±标准差（x?s）表示，采用SPSS for Windows17.0统计软件进行资料分析，采用单因素方差分析比较组间差异，各组间两两比较以最小显著差值法分析，P<0.05表示差别有统计学意义。　　结果：　　1.皮质神经元原代培养及鉴定　　分离的神经细胞4h后贴壁于包被好多聚赖氨酸的培养板上，2、3天后神经元胞体增大，胞质丰富，突起延伸，培养第5、6天，突起继续增长，增粗，培养至第9、10天，神经元分化更加成熟，可见密集的神经元细胞网络。特异βIII微管蛋白鉴定神经元。　　2.倒置相差显微镜观察各组神经元形态学变化　　对照组神经元胞体大，胞质丰富，光晕强，折光性好，突起粗长，神经元分化成熟，可见密集的神经元细胞网络；缺氧组神经元细胞形态出现明显变化，细胞崩解明显，大部分细胞轮廓模糊，细胞突起断裂，胞体固缩成团，胞浆中空泡明显，核碎裂溶解明显；二氮嗪组大部分神经元存活，细胞轮廓清楚，细胞崩解明显减少，胞体固缩明显改善，细胞突起和数量无明显减少，胞浆内空泡明显减少，核碎裂明显减少。格列本脲及细胞松弛素组与缺氧组类似。　　3.流式细胞仪检测各组神经元细胞凋亡率　　对照组、缺氧组、二氮嗪组、格列本脲组、细胞松弛素组细胞凋亡率分别为：10.49%±0.46%，23.80%±1.35%，11.46%±0.79%，23.89%±0.45%及22.95%±1.00%，差异有显著统计学意义（P<0.01），缺氧组、格列本脲组、细胞松弛素组均较对照组增高（P均<0.01），二氮嗪组与对照组差异无统计学意义（P>0.05），格列本脲组、细胞松弛素组均较二氮嗪组增高（P均<0.01）。提示，缺氧可造成神经元细胞凋亡增加，二氮嗪可减轻细胞凋亡，该作用可被格列本脲及细胞松弛素抵消。　　4.免疫荧光化学方法检测细胞内钙离子浓度　　对照组、缺氧组、二氮嗪组、格列本脲组、细胞松弛素组细胞内钙离子平均荧光强度值分别为：2.56±0.43，7.59±1.03，3.23±0.31，7.50±0.44及7.69±0.29，差异有显著统计学意义（P<0.01），缺氧组、格列本脲组、细胞松弛素组均较对照组增高（P均<0.01），二氮嗪组与对照组差异无统计学意义（P>0.05），格列本脲组、细胞松弛素组均较二氮嗪组增高（P均<0.01）。提示，缺氧可造成神经元细胞钙离子浓度增加，二氮嗪可减轻细胞内钙离子超载，该作用可被格列本脲及细胞松弛素抵消。　　5.免疫细胞化学方法检测细胞内caspase-3水平　　对照组、缺氧组、二氮嗪组、格列本脲组、细胞松弛素组caspase-3蛋白阳性细胞平均光密度分别为：450.20±75.93，983.06±64.42，427.19±44.02，1003.03±78.27及981.93±62.48，差异有显著统计学意义（P<0.01），缺氧组、格列本脲组、细胞松弛素组均较对照组增高（P均<0.01），二氮嗪组与对照组差异无统计学意义（P>0.05），格列本脲组、细胞松弛素组均较二氮嗪组增高（P均<0.01）。提示，缺氧可造成神经元细胞caspase-3水平增加，二氮嗪可减轻细胞caspase-3水平，该作用可被格列本脲及细胞松弛素抵消。　　6.免疫荧光化学方法观察及检测细胞骨架的变化　　对照组神经元F-actin主要分布于细胞外周，形成周边肌动蛋白丝带，胞质内偶见短而细的应力纤维，缺氧组神经元细胞周边肌动蛋白丝带消失，F-actin被分解，胞质内应力纤维增多，轴突回缩，神经元特征丧失，二氮嗪组与对照组类似，格列本脲、细胞松弛素组与缺氧组类似。　　对照组、缺氧组、二氮嗪组、格列本脲组、细胞松弛素组F-actin蛋白的平均荧光强度值分别为：5.54±0.43，3.24±0.24，5.26±0.25，2.96±0.58及3.32±0.30，差异有显著统计学意义（P<0.01），缺氧组、格列本脲组、细胞松弛素组均较对照组降低（P均<0.01），二氮嗪组与对照组差异无统计学意义（P>0.05），格列本脲组、细胞松弛素组均较二氮嗪组降低（P均<0.01）。提示缺氧可造成神经元细胞F-actin分解，二氮嗪可减轻细胞F-actin的降解，该作用可被格列本脲及细胞松弛素抵消。　　结论：　　1.缺氧损伤后神经元细胞形态改变明显，细胞轮廓模糊，突起断裂，胞浆中空泡明显，细胞内钙离子浓度增加，caspase-3水平升高，F-actin蛋白降解及细胞凋亡率升高；　　2.经二氮嗪干预后，细胞轮廓清晰，胞浆中空泡及核碎裂溶解不明显，细胞内钙离子浓度降低，caspase-3水平下降，F-actin蛋白降解及细胞凋亡减少，提示二氮嗪对缺氧损伤有明显保护作用，且该作用可被格列苯脲及细胞松弛素B所抵消；　　3.提示二氮嗪对神经元缺氧损伤的保护作用是通过开放mitoKATP通道而起效的，推测mitoKATP通道的开放可稳定细胞骨架从而减少其降解进而来达到脑保护作用。