背景和目的:恶性肿瘤已成为危害人类健康的头号病症之一,常规的化疗﹑放疗及手术治疗对于控制大多数的癌症并不理想。肿瘤患者接受放疗、化疗杀灭肿瘤细胞的同时,由于多数抗肿瘤药物缺乏选择作用,对正常机体也有相当大的损伤,导致骨髓造血功能抑制、消化道反应、肝脏及肾脏等组织的损害、免疫功能下降等。中药配合放、化疗不但可以减轻其副作用,对肿瘤的疗效也有明显提高。单纯的局部客观症状缓解并不能全面反映中医药的疗效,带瘤生存,全身治疗,改善症状,提高生命质量是中医药抗癌的特色所在。因此对天然生物及植物药物有效成分的提取作为新的防癌剂,已成为当今科研工作者们最感兴趣的研究课题。本实验的研究目的是探讨蟾蜍皮水提物的体外抗肿瘤作用。中药抗肿瘤的作用机制是复杂的,不管是单味中药还是复方制剂,都含有多种成份,因此其作用不是单一的,它们可能具有多方面的作用。如何从多层次、多学科对中药抗肿瘤的作用机制进行客观、定性、定量的研究,以进一步揭示其奥秘,尚待中医药科学工作者的不断努力。相信,以数千年中医药理论和实践经验为基础,结合现代药物理论和生物技术,中药的抗肿瘤作用机制研究和临床应用将会有很大的发展。方法:1.细胞培养:肝癌细胞SMMC-7721于含10%新生牛血清、100U/ml青霉素链霉素的DMEM培养培养液中,在37oC、5%C02、饱和湿度条件下,于CO2培养箱中进行培养。2. MTT比色实验:选择在对数生长期生长良好的细胞,制成单细胞悬液,接种细胞于96孔培养板中,其中设空白对照组不加受试细胞。培养24小时后,药物组加入不同浓度的蟾皮水提物,阴性对照组加入等体积的DMEM培养液,于加药后第4小时、8小时、16小时、24小时、48小时、72小时加入MTT检测,求出OD值。(1)Y轴为细胞存活率,X轴为测定时间,制作4-72小时的细胞生长曲线。(2)利用公式计算细胞24小时、48小时、72小时的细胞增殖抑制率。(3)通过EXCEL画图法做趋势线来求24小时、48小时、72小时IC50值。3.集落形成实验:收集对数生长期细胞,接种于六孔板,200个细胞/孔,通过两种方法检测集落形成的情况。设药物组,加入低、中、高浓度的药物。阴性对照组,加入等体积的DMEM培养液。检测药物作用于肝癌细胞48小时后的集落形成情况。4.转移小室实验:药物作用细胞24小时后,转入小室内,CO2孵箱内培养24小时,将小室取出,通过染色、脱水等步骤,将小室底部的膜沿壁切下,中性树胶封片,在光镜下,每个膜分别计数5个视野的穿膜细胞数,求得单个视野的平均穿膜细胞数。结果:1. MTT结果(1)增殖抑制率结果:药物浓度为0.03125mg/ml、0.0625mg/ml、0.25mg/ml时,作用24小时后,对肝癌细增殖抑制率为13%、20%、53%;作用48小时后,抑制率分别为22%、37%、68%;作用72小时后,抑制率为58%、75%、82%。与阴性对照组组相比,效果显著(P<0.05)。(2)生长曲线结果:生长曲线显示药物组细胞生长缓慢。(3)(IC50)值:药物作用于肝癌细胞24小时的(IC50)值为0.2176mg/ml;48小时为0.0655mg/ml;72小时为0.0237mg/ml。2.集落形成率的测定结果:0.005mg/ml药物作用48小时后,去含药培养液,常规培养6天,其集落形成率为12.4%。常规培养5天后,加入不同浓度的药物作用48h后去药物,继续常规培养3天,其集落形成率为14.3%,与对照相比其集落形成率和集落形成抑制率有显著差异(P<0.01)。3. Transwell小室结果:浓度的蟾皮水提物作用24小时后,其穿膜数为25.31,与对照组相比,差异具有显著性(P<0.01)。结论:相同浓度的药物作用于肝癌细胞,随着时间的延长,增殖抑制率随之上升。相同的作用时间,随着药物浓度的增加,增殖抑制率随之上升,呈现出时间浓度依赖性。且低浓度的蟾皮水提物作用肝癌细胞48小时即能抑制其集落形成;作用24小时能抑制其侵袭活性。