近年来2型糖尿病的发病呈快速增长趋势,目前估算到2030年全球糖尿病患病人数将超过3.5亿。由糖尿病引起的死亡人数仅次于心脑血管疾病、恶性肿瘤,被称为“第三杀手”,我国现有糖尿病人数目前居世界第二位。流行病学资料表明,随年龄增加2型糖尿病患病率也明显增加,是影响中老年人健康的主要疾病之一。与糖尿病相关的慢性并发症如心脑血管疾病、糖尿病肾病、糖尿病视网膜病变以及糖尿病神经病变是致死、致残的主要原因,严重威胁人类健康。胰岛素抵抗(insulin resistanse, IR)是肥胖和2型糖尿病早期和重要的发病机制,其定义为由于肝脏、脂肪和肌肉等靶组织对胰岛素生物效应的反应性降低。导致胰岛素抵抗的具体机制尚不十分清楚。骨骼肌是机体葡萄糖、脂质摄取和利用的器官,是胰岛素发挥作用的重要组织。遗传因素和环境因素均可诱导IR的发生,动物和人的实验均表明无论是通过脂质灌注,还是慢性的高脂饮食,血中游离脂肪酸(free fatty acids,FFA)升高均可导致胰岛素抵抗,而且不同类型脂肪酸作用不同,而饱和脂肪酸尤为重要,高脂是诱发IR的独立危险因素之一。长期高脂饮食或短期脂肪酸输入导致人或动物骨骼肌线粒体相关蛋白表达变化和功能异常。老年人、2型糖尿病患者、2型糖尿病一级亲属的骨骼肌线粒体代谢能力下降,而且胰岛素抵抗个体线粒体代谢的标志物的表达已经发生改变、出现线粒体功能下降,导致肥胖和脂质堆积,所以线粒体代谢的标志物在胰岛素抵抗和2型糖尿病发病机制中扮演重要作用。由此可见,骨骼肌线粒体功能紊乱可能是导致IR的一个重要原因,但具体机制尚不清楚。老年人易发生的IR可能与肌肉细胞内的线粒体作用减退或缺陷有关。过氧化物酶体增生物激活受体γ共激活因子1α(peroxisome proliferator-activated receptorγcoactivator 1α,PGC-1α),是一种核转录共激活因子,可调节线粒体生物发生、糖代谢、脂肪酸氧化、胰岛素分泌等诸多生物过程。线粒体融合蛋白2(mitofusin 2,Mfn2),不仅促进线粒体的融合,维持线粒体结构完整性,而且还参与线粒体的代谢调节。核呼吸因子-1(nuclear respiratory factor-1,NRF-1)是一种由核基因组编码的,对线粒体基因组表达的复制转录和翻译过程中重要的酶及蛋白因子起调控作用,对维持线粒体结构与功能发挥重要作用。PGC-1α作为转录共激活因子可以调节Mfn2的表达和NRF-1的转录。因此,骨骼肌线粒体相关因子PGC-1α、Mfn2和NRF-1的表达异常可能导致骨骼肌线粒体形态和功能的改变,其中PGC-1α在线粒体功能和胰岛素抵抗中的作用成为近年来研究的热点。研究发现高脂引起骨骼肌线粒体相关蛋白PGC-1α,Mfn2、NRF-1表达下降,同时伴有胰岛素信号通路相关蛋白的表达异常及胰岛素抵抗,说明骨骼肌线粒体功能和胰岛素抵抗关系密切,而且PGC-1α可能在调控线粒体功能和胰岛素抵抗方面发挥重要作用。目前假说认为血中FFA升高或上述各种原因导致的线粒体功能异常均影响了脂肪酸进入线粒体的氧化过程,从而导致长链乙酰辅酶A(long-chain fatty acyl coenzyme A ,LCACoA)的堆积,甘油二酯(diacylglycerol ,DAG)生成增加,激活蛋白激酶C(protein kinase C ,PKC),进而抑制胰岛素受体底物-1(insulin receptor substrate-1 IRS-1)活性,干扰胰岛素信号传导系统,减低葡萄糖的转运,导致胰岛素抵抗的形成。PGC-1α作为重要的核转录共激活因子是否在高脂导致的线粒体功能变化、胰岛素抵抗中发挥重要作用,其机制是什么,目前国外尚无定论,国内鲜有报道。本课题通过高脂饮食喂养老年大鼠,造成胰岛素抵抗模型,分析胰岛素抵抗状态下和罗格列酮(Rosiglitazone,RSG)干预后骨骼肌线粒体相关蛋白PGC-1α,mfn2、NRF-1的表达变化及相关关系,分析高脂饮食喂养老年大鼠线粒体功能和胰岛素敏感性的变化。采用脂肪酸孵育C2C12肌细胞,了解不同类型脂肪酸对骨骼肌PGC-1α表达的影响,寻找细胞水平研究PGC-1α作用机制的模型,并通过药物和小干扰RNA(small interference RNA,siRNA)技术调节肌细胞PGC-1α的表达,分析线粒体相关蛋白和胰岛素信号通路相关蛋白的表达变化,探讨PGC-1α在高脂、线粒体功能和胰岛素抵抗中的作用机制及其上游调控因子,为研发防治胰岛素抵抗和2型糖尿病的药物提供新的作用靶点和理论依据。本实验内容主要包括以下四部分:第一部分高脂诱导老年胰岛素抵抗大鼠骨骼肌线粒体相关蛋白的表达目的:测定高脂饮食喂养及罗格列酮干预老年大鼠的胰岛素敏感性以及骨骼肌PGC-1α、Mfn2和NRF-1的表达变化,探讨高脂与线粒体功能、IR的关系。方法:22-24月龄老年雄性Wistar大鼠40只随机分为2组:老年对照(OC)组16只、老年高脂(OF)组24只, 4-5月龄青年大鼠16只,为青年对照组(YC)。对照组给予基础饲料,热量组成:碳水化合物65.5%,脂肪10.3%,蛋白质24.2%,总热量为348kcal/100g;OF组给予高脂饲料,其热量组成:碳水化合物20.1%,脂肪59.8 %,蛋白质20.1%,总热量为501kcal/100g;给予老年两组大鼠每日等热量投喂饲料,喂养八周。于喂养第四周末心脏采血测空腹血糖(FBG),胰岛素(INS),血清甘油三酯(TG),血清总胆固醇(TC),游离脂肪酸(FFA)和骨骼肌甘油三酯(TGm)的含量。喂养四周末,每组均随机选8只行高胰岛素-正葡萄糖钳夹试验判断胰岛素抵抗情况,判断造模成功后高脂组随机分为2组:高脂组和罗格列酮干预(OR)组,每组8只,除继续给予高脂饲料外OR组给予罗格列酮3mg/kg灌胃,高脂组给予等量生理盐水灌胃,继续喂养四周。实验第八周末,行高胰岛素-正葡萄糖钳夹试验评价各组胰岛素抵抗情况,实验前抽取血样用于测定血清各项指标;实验结束后颈动脉放血处死动物,留取股四头肌标本,-70℃保存。采用逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)及Western-blot方法检测骨骼肌PGC-1α、Mfn2以及NRF-1的表达。结果:1各组一般项目的比较:与青年组相比,老年对照组空腹胰岛素、空腹血糖和游离脂肪酸在喂养第八周均升高;与老年对照组比较,老年高脂组空腹胰岛素、空腹血糖、游离脂肪酸、总胆固醇和甘油三酯明显升高;罗格列酮干预组空腹胰岛素、空腹血糖、游离脂肪酸、总胆固醇和甘油三酯与老年高脂组比较均下降,差异均有统计学意义(p<0.05或p<0.01)。2骨骼肌甘油三酯含量变化及葡萄糖输注率:与青年对照组相比,在喂养第四周和第八周,老年对照组骨骼肌甘油三酯含量升高,葡萄糖输注率明显降低,差异有统计学意义(P<0.05);与老年对照组相比,老年高脂组骨骼肌甘油三酯从喂养四周后开始升高,葡萄糖输注率下降,第八周骨骼肌甘油三酯含量明显高于第四周,葡萄糖输注率明显低于第四周,差异有统计学意义(P<0.01)。与老年高脂组相比,罗格列酮组骨骼肌甘油三酯含量下降,葡萄糖输注率升高,差异有统计学意义(P<0.01)。3各组大鼠骨骼肌PGC-1α、Mfn2的蛋白表达:在8周末,与青年对照组比较,老年对照组骨骼肌PGC-1α和Mfn2的蛋白表达均下降,差异有统计学意义(P<0.01);老年高脂组较老年对照组下降,差异有统计学意义(P<0.01);罗格列酮干预组PGC-1α和Mfn2的蛋白表达均较老年高脂组升高,但仍低于老年对照组,组间差异有统计学意义(P<0.01)。4各组大鼠骨骼肌PGC-1α、Mfn2以及NRF-1的mRNA表达:与青年对照组比较,老年对照组骨骼肌PGC-1α、Mfn2以及NRF-1的mRNA表达均下降,差异有统计学意义(P<0.01);高脂组较老年对照组下降,差异有统计学意义(P<0.01);罗格列酮干预组PGC-1α、Mfn2以及NRF-1 mRNA表达均较高脂组升高,但仍低于老年对照组,组间差异有统计学意义(P<0.01)。5相关结果表明:相关结果表明,葡萄糖输注率与胰岛素、游离脂肪酸和骨骼肌甘油三酯明显负相关(γ值分别为-0.4931、-0.5825、-0.4270,P值分别为0.0376,0.0112,0.0398。骨骼肌PGC-1α与Mfn2、NRF-1呈正相关,γ值分别为0.4931、0.532,P值为0.0076、0.002。结论:1.高脂饮食喂养老年大鼠,血FFA升高,骨骼肌甘油三酯升高,葡萄糖输注率下降,成功造成胰岛素抵抗模型。2.高脂饮食喂养老年大鼠骨骼肌PGC-1α以及线粒体蛋白Mfn2和NRF-1表达下降。3.高脂饮食喂养的老年大鼠,其骨骼肌PGC-1α与Mfn2、NRF-1之间存在正相关关系。4.罗格列酮干预后,大鼠胰岛素敏感性增强,骨骼肌PGC-1α、Mfn2和NRF-1表达升高,验证了PGC-1α与线粒体功能、IR的密切关系。第二部分不同脂肪酸对C2C12肌细胞PGC-1α表达的影响目的:采用不同类型长链脂肪酸分别培养小鼠C2C12肌细胞,测定其PGC-1αmRNA和蛋白的表达,在细胞水平探讨脂肪酸类型对骨骼肌PGC-1α的影响,为进一步研究PGC-1α与高脂、线粒体功能、胰岛素抵抗的关系打基础。方法:用含10 %新生小牛血清的DMEM培养C2C12肌细胞,接种于6孔板中,培养24h后换为无血清培养基,分别加入软脂酸组(C16:0)、硬脂酸组(C18:0)、棕榈酸组(C16:1)、油酸组(C18:1)以及亚油酸组(C18:2)孵育,均设置0.25mM、0.5 mM和0.75 mM三个浓度梯度,继续培养24h。采用实时荧光定量PCR及Western-blot方法检测细胞中PGC-1α的表达。结果:1不同浓度长链脂肪酸对C2C12细胞PGC-1α表达的影响:在0.25mM浓度时,软脂酸组、硬脂酸组、棕榈酸组、油酸组以及亚油酸组肌细胞PGC-1αmRNA和蛋白表达较对照组差异无统计学意义(P> 0.05);在0.5 mM和0.75 mM浓度时,软脂酸组肌细胞PGC-1αmRNA和蛋白表达较对照组降低(P <0.05);硬脂酸组、棕榈酸组、油酸组、亚油酸组PGC-1αmRNA和蛋白表达与对照组相比差异无统计学意义(P>0.05)。2软脂酸培养的C2C12细胞不同时间PGC-1α表达变化:PGC-1αmRNA和蛋白表达在1h与0h比较差异无统计学意义(P>0.05),而在培养6h、12h和24h的PGC-1αmRNA和蛋白表达较0h降低,其中24h降低最明显,差异有统计学意义(P <0.01)。结论:1软脂酸孵育的C2C12肌细胞PGC-1α的mRNA和蛋白表达下降,并且有浓度和时间依赖性。2单不饱和或多不饱和脂肪酸培养的C2C12肌细胞对PGC-1α表达无明显影响。第三部分C2C12肌细胞PGC-1α表达对线粒体相关蛋白和胰岛素信号通路蛋白的影响目的:通过二甲双胍、罗格列酮和AMPK激动剂(AICAR)孵育C2C12细胞,筛选上调PGC-1α效率最高的药物,分别采用药物上调和siRNA抑制PGC-1α的表达,分析PGC-1α表达变化对粒体功能相关蛋白和胰岛素信号通路蛋白的影响,探讨PGC-1α在线粒体功能紊乱、IR中的作用。方法:细胞培养与传代同第二部分。C2C12细胞分别以2mmol/l二甲双胍、2mmol/l罗格列酮及10μmmol/l AMPK激动剂(AICAR)孵育30 min,然后加入0.5 mM的C16:0软脂酸孵育24h,收取各组细胞并测定PGC-1α的表达。通过上述方法筛选出上调PGC-1α效率最高的药物,采用此药物上调PGC-1α(分对照组、软脂酸组和药物干预组)测定PGC-1α、Mfn2、NRF-1、IRS-1以及GLUT4的蛋白表达。将C2C12细胞转染PGC1α的特异性siRNA(PGC1α-siRNA组)或无关序列对照siRNA(NS-siRNA组)6小时后以10μmmol/l AICAR孵育细胞48h,并设阴性对照组、AICAR组做为比较,分别测定PGC-1α、Mfn2、NRF-1、IRS-1以及GLUT4的蛋白表达。结果:1药物对软脂酸孵育的C2C12细胞PGC-1α表达的影响:二甲双胍、罗格列酮和AICAR组与对照组比较均使肌细胞PGC-1α蛋白表达升高,但以AICAR组最明显,差异有统计学意义(P <0.01),所以接下来选用AICAR作为上调药物研究其它蛋白的表达。2应用AICAR上调C2C12细胞PGC-1α表达后线粒体相关蛋白的变化:软脂酸组PGC-1α蛋白表达较对照组低,AICAR组较软脂酸组、对照组升高;软脂酸组Mfn2、NRF-1蛋白的表达与对照组相比均降低,差异有统计学意义(P <0.01);AICAR干预组Mfn2蛋白表达较软脂酸组升高(P <0.01),较对照组无统计学差异(P >0.05),NRF-1蛋白表达较软脂酸组升高(P <0.01),但较对照组仍低(P <0.05)。3应用AICAR上调C2C12细胞PGC-1α后胰岛素信号通路相关蛋白表达的变化:软脂酸组IRS-1、GLUT4的蛋白表达较对照组降低,差异有统计学意义(P <0.01),AICAR干预组IRS-1和GLUT4的蛋白表达较软脂酸组升高,但较对照组低,差异有统计学意义(P <0.01)。4应用siRNA下调C2C12细胞PGC-1α后线粒体相关蛋白的表达变化:AICAR组和NS-siRNA组PGC-1α表达较对照组升高,差异有统计学意义(P <0.01),AICAR组和NS-siRNA组相比表达无明显变化,PGC-1α-siRNA组PGC-1α表达较其余三组均下降(P <0.01);AICAR组和NS-siRNA组Mfn2和NRF-1的蛋白表达均较对照组增加,差异有统计学意义(P <0.01),NS-siRNA组与AICAR组比较无统计学差异(P >0.05),PGC-1α-siRNA组Mfn2、NRF-1蛋白表达与对照组无差异,较AICAR组和NS-siRNA组明显下降,差异均有统计学意义(P <0.05或P <0.01)。5应用siRNA下调C2C12细胞PGC-1α后胰岛素信号通路蛋白的表达变化:IRS-1蛋白表达在PGC-1α-siRNA组较对照组、AICAR组和NS-siRNA组降低,差异均有统计学意义(P <0.05),在对照组、AICAR组和NS-siRNA组比较无统计学差异(P >0.05);GLUT4的蛋白表达在AICAR组和NS-siRNA组均较对照组增加(P <0.01),PGC-1α-siRNA组与对照组比较无明显变化(P >0.05),与AICAR组和NS-siRNA组比较明显下降(P <0.01)。结论:1.二甲双胍、罗格列酮以及AICAR干预均可以使软脂酸孵育的C2C12细胞PGC-1α表达上调,而AICAR的上调作用最明显,二甲双胍、罗格列酮以及AICAR可能逆转了软脂酸对C2C12的作用。2.药物上调或siRNA下调C2C12细胞PGC-1α的表达同时伴有线粒体相关蛋白以及胰岛素信号通路蛋白的变化,表明PGC-1α表达下降与线粒体功能异常及IR密切相关。3.高浓度软脂酸诱导的线粒体功能下降由PGC-1α介导。第四部分MAPKs信号通路对C2C12肌细胞PGC-1α表达的调控作用目的:测定软脂酸培养的C2C12细胞ERK,p38MAPK(p38)和JNK的表达水平,并用p38MAPK抑制剂(SB203580)干预软脂酸培养的C2C12细胞,测定PGC-1α的表达变化,揭示MAPKs信号通路与PGC-1α表达的关系,寻找软脂酸诱导C2C12细胞PGC-1α表达变化的上游调节通路。方法:细胞培养与传代同第二部分。以0.5 mM的C16:0软脂酸孵育C2C12细胞,分别于0h、0.5h、1 h、6 h和12 h收取细胞检测PGC-1α和ERK、JNK、p38及其磷酸化蛋白的表达水平。用p38MAPK抑制剂干预后测定PGC-1α、P38及p-P38的表达(分为对照组,软脂酸组,p38MAPK抑制剂组,软脂酸+p38MAPK抑制剂组)。肌细胞ERK、JNK、p38和PGC-1α蛋白表达用Western-blot方法检测。结果:1软脂酸培养的C2C12细胞ERK和JNK的表达:ERK和P-ERK以及JNK和P-JNK的表达在1h、6h、12h以及24h较0h无明显变化,其差异均无统计学意义(P >0.05)。2软脂酸培养的肌细胞p38MAPK的表达:p38MAPK的表达在1h、6h、12h以及24h较0h无明显变化,其差异无统计学意义(P >0.05)。P-p38MAPK的表达在1h、6h、12h以及24h逐渐升高,组间两两比较差异均有统计学意义(P <0.05)。3用p38MAPK抑制剂干预C2C12细胞后PGC-1α的表达:PGC-1α的表达在软脂酸组与其它三组比较最低(P <0.01),p38MAPK抑制剂组和软脂酸+p38MAPK抑制剂组较软脂酸组升高(P <0.01),p38MAPK抑制剂组最高(P <0.01)。结论:1.在软脂酸培养的不同时间(0-12h)的C2C12细胞的p38MAPK表达无变化,而P- p38MAPK表达逐渐升高;2.在软脂酸培养的不同时间(0-12h)的C2C12细胞ERK、P-ERK以及JNK、P-JNK表达无明显变化;3.用p38MAPK抑制剂干预软脂酸培养的C2C12细胞,PGC-1α表达较加入抑制剂前明显升高,表明软脂酸诱导的的PGC-1α表达下降可能由p38MAPK调控。