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NF-kB及其效应分子是天然免疫系统的重要组成部分,病原体感染机体以后,NF-kB信号通路激活产生效应分子积极清除病原体,同时NF-kB信号通路受到机体严密的调控,避免产生过多的炎症因子损伤免疫系统。长期以来关于NF-kB信号通路的研究一直是热点课题,尽管已经非常清楚NF-kB信号通路发生的基本过程,但是如何精细地调控NF-kB信号通路依然是个复杂问题,需要进一步研究和探索。通过生物信息学方法预测GM114和TRAF家族蛋白存在相互作用,有研究报道GM114是果蝇Bam蛋白的同源物,GM114-/-小鼠生殖功能是正常的,并没有发现GM114具备调控干细胞分化的能力,GM114属于KIZ家族,不同物种间KIZ蛋白高度保守,KIZ蛋白可以定位在中心体上,PLK1可以使KIZ发生磷酸化,从而促进细胞周期M期的发生。因此,我们对GM114新的功能产生兴趣,想知道GM114是否在NF-kB信号通路上具有调控作用。结果发现在Raw264.7和MEF细胞中分别敲低GM114表达可以促进NF-kB信号通路的发生,KIZ与GM114是同一家族,两者的同源性达到67%,敲低KIZ同样促进IL-1β激活的NF-kB信号通路,这说明GM114和KIZ的功能非常保守,敲低GM114并没有改变JNK和ERK磷酸化发生的时间,也不能促进TNFα激活的NF-kB信号通路,所以GM114特异性调控TLR4和IL-1β受体介导的NF-kB信号通路。 GM114参与了NF-kB信号通路的调控过程,敲低GM114可以促进NF-kB信号通路的激活过程,说明GM114可能是NF-kB信号通路上的负调控因子,那么GM114调控目标分子是什么,分子机制又是什么?过表达KIZ抑制NF-kBluciferase报告基因的表达,这种调控主要发生在IRAK1复合体上,免疫共沉淀结果进一步显示IRAK1可以促进Pellin2与GM114之间的相互作用, Pellino2是RING家族泛素连接酶,令人兴奋的是IRAK1不仅仅促进Pellino2同GM114之间的结合,还可以增强Pellino2对GM114的泛素化修饰,而IRAK1激酶失活型突变体不能增强Pellin2对GM114的泛素化修饰,说明Pellino2发生磷酸化修饰是个必要条件。Pellino2主要调控对象是IRAK1,过表达GM114抑制Pellino2对IRAK1的泛素化修饰,敲低GM114增强了内源IRAK1泛素化水平,因此GM114通过竞争Pellino2平衡IRAK1泛素化水平可以反向调控NF-kB信号通路。 果蝇Toll通路和哺乳动物NF-kB信号通路高度保守,果蝇的Pellino和哺乳动物的Pellino2之间同源性最高,可以达到56%,那么在果蝇体内Pellino是否可以发挥类似的功能?通过体外细胞实验发现Pellino是个负调控因子,敲低Pellino的表达可以促进Toll的激活过程,提高Drosomycin的表达水平,过表达Pellino反过来抑制Drosal mRNA水平,说明Pellino可以负向调控Toll信号通路。MyD88是Toll通路上的关键组分,它定位在细胞膜上可以募集更多的效应分子参与激活信号通路,当Toll信号通路激活以后可以诱导Pellino通过MyD88向细胞膜上聚集,Pellino是RING家族泛素连接酶,MyD88招募Pellino可以形成K48位泛素链,从而影响了MyD88的稳定性,敲低Pellino的表达降低了MyD88泛素化水平,增强MyD88的稳定性。因此在果蝇体内Pellino通过MyD88形成一个负反馈调节通路负控制Toll信号通路,从而保证激活信号适度有序的进行。