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溶癌腺病毒载体(Oncolytic adenovectors)，又称条件复制型腺病毒载体(Conditionally replicating adenoviruses，CRADs)，其中条件复制的含义是指这种腺病毒载体能够在肿瘤细胞中特异性复制，通过病毒扩增，裂解、杀伤肿瘤细胞，而在正常细胞中不能扩增或扩增率极低[1]。正是由于CRADs能够在肿瘤细胞中复制、传播的特性，从而较好地克服了复制缺陷型病毒载体在基因治疗中的基因转移效率低，难以杀灭大多数肿瘤细胞这一缺点，现已广泛用于肿瘤基因治疗研究中。通常CRADs携带治疗基因后，较不含治疗基因的CRADs能够更有效的杀伤肿瘤细胞。 为解决重组复制缺陷型腺病毒治疗恶性肿瘤存在的靶向性差、目的基因表达持续时间短等缺点，本研究采用CRADs构建的传统方法:利用穿梭质粒和骨架质粒在细胞中同源重组来获得重组病毒，最后通过空斑纯化，排除污染、获得均一的目的病毒。具体策略为:利用分子生物学手段对野生7型腺病腺病毒(Adenovirus，Ad)毒进行双重修饰:一方面利用肿瘤特异性的人端粒酶逆转录酶(human telomerasereverse transcriptase，hTERT)启动子来调控制溶癌过程所必需的E1A和E1B-55kDa基因的表达;另一方面将干扰溶癌过程且病毒复制非必需的E1B-19kDa基因进行缺失，使得到的重组病毒既能保持肿瘤增殖特异性，又具有较高的溶癌效率。 首先构建病毒转移质粒pITR-IRES-HEAB。具体为将从人基因组DNA扩增的hTERT启动子，克隆替换前期构建的质粒pIRES-HEAB(携带腺病毒E1A和E1B-55kDa区)的PCMV IE启动子，具体构建程序为:参照Genbank的Ad7基因组全序列(BK005235)，PCR扩增E1A的完整ORF片段，克隆至pIRESneo(clontech)的多克隆位点;扩增E1B-55kDa，克隆至pIRESneo的SmaⅠ/XbaⅠ位点，替换Neor片段;最后PCR扩增Ad7左侧1-470片段并克隆至pIRES-HEAB质粒的hTERT基因上游，获得最终的病毒转移质粒pITR-IRES-HEAB。 野生Ad7病毒株经分离、培养及鉴定后，大量扩增病毒，提取其基因组DNA，利用NhelⅠ酶切获得野生Ad7病毒基因组NhelⅠ大片段(795-14220)，酶切野生Ad7病毒基因组得到NotⅠ片段(13171-ITR)，将其回收后做为Ad7病毒基因组骨架序列。根据基因序列的互补重叠部分，将上述酶切片段与病毒转移质粒pITR-IRES-HEAB通过脂质体共转染至A549细胞株，实现细胞内基因重组，重组出新型溶癌腺病毒 Ad7OL，空斑纯化后，提取重组腺病毒的DNA进行PCR、酶切分析，确定为重组正确的腺病毒株后，进一步用CsCl密度梯度离心纯化，并用终点稀释法(end pointdilution assay, EPDA)测定病毒的滴度。 为了初步研究重组溶癌腺病毒Ad7OL的体外抑杀瘤作用，选用3种端粒酶阳性肿瘤细胞系和1种端粒酶阴性细胞系:A549(人肺癌细胞株)、Hela(人宫颈癌细胞株)和293(人胚肾细胞系);LO2（人胎肝细胞系），从而评价载体的选择性肿瘤杀伤效应。将Ad7OL或野生Ad7感染正常细胞及肿瘤细胞，感染后7d，结晶紫染色法检测病毒细胞毒性。 总之，本研究在野生7型腺病毒基础上，成功构建的E1A/E1B双重修饰的溶癌病毒，基本上能满足理想肿瘤增殖病毒主要要求，是研制溶癌病毒过程中的一个有益尝试，也希望本课题所设计的7型溶癌腺病毒能为利用不同血清型来源的腺病毒研制多样化的肿瘤增殖病毒，从而治疗不同组织来源的肿瘤提供一个新的技术途径和研究思路。