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扩展青霉脂肪酶(PEL)可在油水界面催化甘油三酯水解生成脂肪酸和甘油,是工业生产上一种重要的水解酶。本研究利用叠加突变技术手段,对扩展青霉脂肪酶(Penicillium expansum lipase, PEL)进行热稳定性的蛋白质工程改造。ep8是由本课题组前期获得的含有一个突变点的扩展青霉脂肪酶随机突变体,其热稳定性比野生型有所提高。作者以ep8为模板,利用重叠延伸PCR构建了pPIC3.5K-ep8-K56R、pPIC3.5K-ep8-P90D、pPIC3.5K-ep8-E207P、pPIC3.5K-ep8-E221P、pPIC3.5K-ep8-K226A、pPIC3.5K-ep8-P82D、pPIC3.5K-ep8-E113P、pPIC3.5K-ep8-I164S、pPIC3.5K-ep8-K115P、pPIC3.5K-ep8-S139R、pPIC3.5K-ep8-N157Y、pPIC3.5K-ep8-K56R-K115R等突变基因表达载体。将这些携带突变基因的表达质粒转化入毕赤酵母GS115,获得了12种含有突变基因的脂肪酶基因工程菌：PEL-ep8-K56R-GS、PEL-ep8-P90D-GS、PEL-ep8-E207P-GS、PEL-ep8-E221P-GS、PEL-ep8-K226A-GS、PEL-ep8-P82D-GS、PEL-ep8-E113P-GS、PEL-ep8-I164S-GS、PEL-ep8-K115P-GS、PEL-ep8-S139R-GS、PEL-ep8-N157Y-GS、PEL-ep8-K56R-K115R-GS。通过平板、摇瓶发酵并在甲醇的诱导下进行突变脂肪酶表达,突变脂肪酶的温度适宜性和热稳定性,结果显示：PEL-ep8-K56R、PEL-ep8-P90D、PEL-ep8-E207P、PEL-ep8-E221P、PEL-ep8-K226A、PEL-ep8-P82D、PEL-ep8-E113P、PEL-ep8-I164S、PEL-ep8-K115P、PEL-ep8-S139R、PEL-ep8-N157Y、PEL-ep8-K56R-K115R等12个叠加突变体中,(1)叠加突变体PEL-ep8-K56R的最适作用温度为37℃,比野生型脂肪酶PEL的最适作用温度下调了3℃,热稳定性(Tm)比野生型提高了1.4℃,比随机突变体PEL-ep8提高了0.2℃。发酵酶活约为852U/ml,是一个热稳定性获得一定提高的突变体。(2)叠加突变体PEL-ep8-P90D最适作用温度比野生型PEL-GS降低6℃,Tm比随机突变体PEL-ep8低0.8℃,比野生型高0.1℃；发酵酶活约为584U/mL。(3)叠加突变体PEL-ep8-K56R-K115R-GS的Tm值为37.5℃,比野生型下降了2.5℃；发酵酶活约为56U/mL。(4)叠加突变体PEL-ep8-E207P、PEL-ep8-E221P、PEL-ep8-K226A、PEL-ep8-P82D、PEL-ep8-E113P、PEL-ep8-I164S、PEL-ep8-K115P、PEL-ep8-S139R及PEL-ep8-N157Y均不能够在YPOM板上形成透明圈,SDS-PAGE分析亦无脂肪酶目的蛋白。综上,通过本研究获得了一株热稳定性有所提高的脂肪酶叠加突变体PEL-ep8-K56R,其热稳定性(Tm)比野生型提高了1.4℃,比随机突变体PEL-ep8提高了0.2℃；其发酵酶活比野生型提高了21.1%、比随机突变体提高了3.4%,为今后进行多重叠加突变体研究奠定了基础。