贵州本地高羊茅组织培养及遗传转化体系的研究

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高羊茅是禾本科羊茅属多年生草本植物,具有耐践踏、易再生、适应性强、寿命长等特点,原产西欧、北非,现广泛分布于世界各地,已广泛应用于我国多个省市,包括江西、江苏、四川、贵州、北京等。高羊茅草质好、营养丰富,青饲、晒制干草均可,是与豆科牧草混播建植放牧草地的优良草种。但目前高羊茅草种的需求仍基本依赖于进口,在一定程度上极大限制我国草业的快速发展。黔草1号和黔草2号均是利用贵州野生高羊茅作亲本材料历经数年定向培育而成的贵州本地品种,与传统育种技术相比,运用生物技术改良草种品种并培育出新品种已日益受重视。本研究以黔草1号和黔草2号的种子为外植体,通过研究不同影响因素(包括种子的预处理方式、基本培养基、品种和激素)对愈伤组织形成和分化的影响,建立贵州本地高羊茅品种的组织培养和植株再生体系,为利用基因工程技术培育出更适应贵州地区且生长状态表现更加优异的高羊茅新品种打下基础。1.对高羊茅种子的预处理结果显示,0.1%HgCl2处理0s和15s时的发芽率最高,且各品种的发芽率有横向切割发芽率>纵向切割发芽率>未切割发芽率;处理时间超过30s后的发芽率急速下降,处理时间分别为45s和60s各品种的发芽率有纵向切割发芽率<横向切割发芽<未切割发芽率。未经过0.1%HgCl2处理的种子的愈伤组织后期污染情况严重。2.贵州本地品种的高羊茅成熟种子的愈伤组织诱导和分化的结果表明,MS培养基是最适宜采用的基本培养基,两个本地品种的诱导率分别达到76.3%和75.6%;2,4-D对高羊茅的愈伤组织有明显的促进作用,6-BA则有明显的抑制作用,在2,4-D浓度<7mg/L时,随着浓度的增加诱导率增加,在浓度为7mg/L时的诱导率达到最大值,两个本地品种的诱导率分别达到74.9%和72.3%,浓度超过7mg/L时,随着浓度的增加诱导率下降,6-BA浓度为2mg/L时愈伤组织的分化情况最好,两个本地品种的分化率分别达到42.5%和37.5%。3.影响贵州本地高羊茅品种的农杆菌遗传转化的因素分析表明:转化前的最佳预培养时间为4天,两个本地品种的转化效率达到56.7%和52.6%;适宜的农杆菌浓度OD600值为0.6,两个本地品种的转化效率达到59.4%和51.5%,浸染时间以15~20min较为合适;适合的共培养的pH值范围为5.6~6.0,且以5.8~6.0最适宜,最大转化效率达到56.7%和52.8%;适合的共培养时间为2d~4d,以3d~4d最合适,最大转化效率达到52.4%和50.1%。
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