旋毛虫是一种食源性寄生虫。在旋毛虫寄生期间,宿主需要尽可能的排出病原生物,而寄生虫需要在宿主体内成功繁殖和生存,因此在寄生过程中逐渐进化出一种复杂的宿主-寄生虫相互作用关系,而旋毛虫serpin型丝氨酸蛋白酶抑制剂(TsSPI)在这一过程中可能发挥重要作用。TsSPI在旋毛虫ML、AW、NBL中都有表达,其中在ML期表达水平最高。本研究旨在通过RNAi研究TsSPI在旋毛虫入侵以及调节宿主免疫方面的功能,同时探讨重组蛋白TsSPI在体外对巨噬细胞极化的影响。本研究利用RNA干扰技术来探索TsSPI基因在旋毛虫生命周期中的功能。设计合成三条特异性siRNA(siRNA-153、siRNA-479、siRNA-986),同时体外合成特异性dsRNA-TsSPI,利用脂质体辅助浸泡的方法将特异性siRNA和dsRNA传递到旋毛虫肌幼虫体内,结果发现RNAi可以有效地传递到旋毛虫肌幼虫体内;利用qPCR和Western-blot检测TsSPI基因转录水平和蛋白表达水平,结果发现siRNA和dsRNA-TsSPI的沉默效果为剂量依赖性,且2μM siRNA或60ng/μl dsRNA为最佳的作用浓度;三组特异性siRNA和dsRNA-TsSPI均可有效的降低TsSPI基因转录水平和蛋白表达水平,其中siRNA-986和dsRNA-TsSPI效果最佳,考虑到成本,后续实验均利用60ng/μl dsRNA-TsSPI进行;利用dsRNA-TsSPI浸泡处理旋毛虫2 d后开始有很好的沉默效果,3 d后沉默效果最佳,而且持续到7 d依旧有显著的沉默效果,可见在后续感染实验中,整个肠期感染阶段(感染后3-7 d)内经过dsRNA-TsSPI浸泡处理的旋毛虫都处于TsSPI基因沉默状态;利用检测dsRNA-TsSPI处理后的旋毛虫中Ts Ka SPI的基因转录水平及蛋白水平的方法验证dsRNA-TsSPI干扰的特异性,结果显示dsRNA-TsSPI特异性良好。在本研究中,dsRNA介导的TsSPI基因沉默不影响幼虫在体外的蜕皮和存活率,但降低旋毛虫体外入侵肠上皮细胞的能力。将各组旋毛虫肌幼虫感染小鼠,结果发现与对照感染组相比,TsSPI基因沉默组小鼠肠道成虫荷和肌肉中肌幼虫数量均显著降低,但两组之间相同数量的成虫产出的新生幼虫数量没有差异。dsRNA干扰遗传性分析结果显示,旋毛虫成虫的TsSPI基因依旧受到抑制,而P 1代肌幼虫中TsSPI基因已经基本恢复到正常水平。因此我们推测肌肉中P 1代肌幼虫数量降低可能是肠道成虫荷降低导致的。将dsRNA-TsSPI介导的TsSPI基因沉默的旋毛虫感染小鼠,小鼠感染后4 d、7 d取腹腔巨噬细胞,用ELISA检测试剂盒检测小鼠腹腔巨噬细胞培养上清中炎性细胞因子含量,结果显示,与对照组相比,感染旋毛虫后,小鼠腹腔巨噬细胞培养上清中促炎性细胞因子TNF-α、IL-6、IL-1β、IL-12和抗炎性细胞因子TGF-β、IL-10含量均有不同程度的升高,而这种促炎性细胞因子和抗炎性细胞因子形成的混合体内环境有利于旋毛虫的寄生;与感染后4 d相比,感染后7 d,促炎性细胞因子含量均有不同程度的降低,而抗炎性细胞因子含量没有显著变化。与感染未经过处理的旋毛虫的小鼠相比,感染TsSPI基因沉默的旋毛虫小鼠腹腔巨噬细胞培养上清中炎性细胞因子含量均有不同程度的升高。可见TsSPI基因沉默后,旋毛虫引起的宿主炎性反应显著加剧,说明TsSPI可能通过影响宿主炎症因子之间的平衡缓解旋毛虫引起的宿主炎性反应。利用Western blot检测各组小鼠巨噬细胞P65磷酸化水平变化,结果显示,与对照组相比,感染旋毛虫的小鼠腹腔巨噬细胞P65磷酸化水平显著升高;和感染后4 d相比,感染后7 d小鼠腹腔巨噬细胞P65磷酸化显著降低,间接证明了随着感染时间的推移,旋毛虫引起的宿主免疫反应从Th1/Th2混合型反应转变为Th2型免疫反应为主。而与感染未经处理的旋毛虫的小鼠相比,感染TsSPI基因沉默的旋毛虫小鼠腹腔巨噬细胞P65磷酸化水平显著升高,说明TsSPI可以缓解旋毛虫感染引起的巨噬细胞NF-κB的磷酸化,进而抑制宿主炎症反应。利用qPCR检测旋毛虫感染后腹腔巨噬细胞中效应因子CAM标志物i NOs和AAM标志物Arg-1的m RNA表达量,结果显示,与对照组,感染旋毛虫的小鼠腹腔巨噬细胞效应因子i NOs以及Arg-1的表达量均显著升高;和感染后4 d相比,感染后7 d小鼠腹腔巨噬细胞i NOs表达量显著降低,而Arg-1表达量则显著升高,说明旋毛虫感染可以调节宿主巨噬细胞极化。与感染未经处理的旋毛虫的小鼠相比,感染TsSPI基因沉默的旋毛虫的小鼠腹腔巨噬细胞中效应因子i NOs的相对表达量显著升高,而效应因子Arg-1的相对表达量显著降低,说明TsSPI在旋毛虫调节宿主巨噬细胞极化过程中发挥重要作用。诱导表达重组蛋白TsSPI和mu TsSPI,其中mu TsSPI为丝氨酸蛋白酶抑制剂活性降低的突变体TsSPI。qPCR检测各CAM相关因子转录水平变化,结果显示,TsSPI可以抑制LPS介导巨噬细胞分泌CAM相关促炎性细胞因子TNF-α、IL-6、IL-1β、IL-12和效应因子i NOs的转录表达,同时利用Western blot检测巨噬细胞P65磷酸化水平和IRAK、IκB的蛋白表达情况,结果显示,TsSPI可以抑制LPS介导的IRAK、IκB降解以及P65磷酸化,并且如果改用突变体刺激,以上调节功能均明显减弱。可见TsSPI可以依赖丝氨酸蛋白酶抑制活性抑制LPS介导的NF-κB通路活性,并进一步抑制促炎性细胞因子和效应因子i NOs的释放,阻止巨噬细胞向CAM极化。利用重组蛋白TsSPI和mu TsSPI直接刺激巨噬细胞。qPCR检测各AAM相关因子转录水平变化,结果显示,TsSPI可以有效的促进AAM相关抗炎性细胞因子TGF-β、IL-10和效应因子Arg-1的转录表达。同时利用Western blot检测巨噬细胞JAK2和STAT3磷酸化水平,结果显示,TsSPI可以刺激激活JAK2和STAT3发生磷酸化,改用突变体刺激并不影响这种调节功能。可见TsSPI可以刺激激活JAK2/STAT3信号通路,同时促进抗炎性细胞因子TGF-β、IL-10和AAM标志效应因子效应因子Arg-1的分泌,促进巨噬细胞向AAM极化。综上所述,dsRNA-TsSPI可以特异而有效的抑制TsSPI的基因转录水平及蛋白水平。TsSPI可能不直接参与寄生虫自身的生长和繁殖,但在一定程度上参与调节旋毛虫与宿主的相互作用。TsSPI基因沉默可以增强巨噬细胞NF-κB的磷酸化水平,促进巨噬细胞分泌炎性细胞因子,调节巨噬细胞极化。重组蛋白TsSPI可以依赖丝氨酸蛋白酶抑制活性抑制LPS介导的NF-κB通路活性,同时刺激激活JAK2/STAT3信号通路,并调节相应细胞因子和效应因子的表达。TsSPI可能通过调节巨噬细胞极化,进而影响宿主炎症因子之间的平衡,从而调节宿主免疫反应,为旋毛虫在宿主中的定殖创造有利环境。