论文部分内容阅读
背景与目的:纤维化发生是预测慢性肝损伤和疾病进展的重要因素,但目前尚缺少可靠指标预测早期肝纤维化。新研究数据表明:胆管反应（ductular reaction,DR）和纤维化发生存在机制联系,暗示血清中DR相关分子是肝纤维化无创诊断标志物的潜在候选因子。因此,在本研究中,我们探索血清中DR相关分子的表达,并评估其与组织中DR和纤维化生成的相关关系。进一步地,初步探讨DR促进肝纤维化进程的可能机制。方法:利用含有0.1%1,4-二氢-2,4,6-三甲基-3,5-吡啶二甲酸二乙酯（3,5-diethoxycarbonyl-1,4-dihydrocollidine,DDC）饲料,含 300mg/L 硫代乙酰胺（thioacetamide,TAA）的饮用水,或蛋氨酸-胆碱缺乏（methionine-and-choline deficient,MCD）饲料分别喂养7-8周龄的雄性C57BL/6小鼠构建慢性肝损伤肝纤维化模型,每个模型每个时间点小鼠数量为4-5只。对照组小鼠喂食普通饲料和灭菌水。分别于喂养的1w,2w,4w,6w,8w,12w或16w留取肝组织和血清样本。HE染色观察肝组织常规形态学变化。天狼猩红染色观察胶原纤维在肝组织的沉积,并利用Ishak评分系统对纤维化程度进行评分。免疫组织化学染色观察DR相关分子细胞角蛋白19（Keratin 19,K19）、Y染色体性别决定区相关高速泳动族框因子9（Sry HMG box protein 9-positive,SOX9）,纤维化相关分子α-平滑肌蛋白（alpha-smooth muscle protein,α-SMA）在肝组织的表达和分布。RT-PCR检测肝组织中DR、纤维化相关分子和肝细胞核因子4α（hepatocyte nuclear factor 4 alpha,HNF4α）mRNA 的表达水平。Western Blot 检测HNF4α蛋白的表达水平。酶联免疫吸附法测定血清中K19和K18的表达。采用全自动生化分析仪检测血清中谷丙转氨酶（alanine transaminase,ALT）和谷草转氨酶（aspartate transaminase,AST）的表达。在体外实验中,我们利用病毒感染人肝癌细胞HepG2或小鼠正常肝细胞AML12调控HNF4α的表达;利用转化生长因子β1（Transforming growth factorβ1,TGFβ1）诱导小鼠正常肝细胞AML12发生上皮-间质转化（epithelial-to-mesenchymal transition,EMT）。免疫荧光染色观察肝细胞极性、EMT相关分子和HNF4α在肝细胞中的表达和分布。RT-PCR检测肝细胞中极性、EMT相关分子和HNF4α mRNA的表达水平。Western Blot检测极性相关分子和HNF4α蛋白的表达水平。结果:组织学上,在DDC模型中,DR相关分子K19和SOX9与纤维化相关分子α-SMA以及天狼猩红染色的阳性区域均出现在肝组织的汇管区,且K19和SOX9的阳性染色区域面积与α-SMA和天狼猩红的阳性染色区域面积显著正相关（r＞0.6,P＜0.05 forall）。显著升高的DR相关分子K19、SOX9、K7、肝细胞核因子1β（hepatocyte nuclear factor 1β,HNF1β）与显著升高的纤维化相关分子TGFβ1、α-SMA 的 mRNA 表达水平也显著相关（r＞0.6,P＜0.05 for all）。与组织学中DR和纤维化的结果相一致,DDC模型中血清K19及其片段CYFRA21-1、K18-M65及其片段K18-M30、ALT和AST的表达均随着肝损伤持续主要呈不断上升的趋势。进一步地,血清K19和CYFRA21-1分别与组织中DR相关分子K19和SOX9,以及纤维化相关分子α-SMA、天狼猩红染色的阳性区域面积,包括纤维化评分均显著正相关（r＞0.4,P＜0.05 for all）,且对其标识的组织DR和纤维化均具有很好的鉴别能力（AUROC＞0.7,P＜0.05 for all）。血清 K19 和 CYFRA21-1 分别与 DR 相关分子 K19、SOX9、K7、HNF1β以及纤维化相关分子TGFβ1、α-SMA的mRNA表达水平也显著相关（r＞0.6,P＜0.05 forall）。在TAA和MCD模型中取得了近似于DDC模型的结果。血清K18-M65、K18-M30、ALT和AST与组织中DR和纤维化的相关性在三种模型中不一致甚至不相关。另外,三种模型中显著下降的HNF4α mRNA和蛋白的表达水平与组织中DR相关分子的表达显著相关（r的绝对值＞0.4,P＜0.05 for all）。体外实验中,肝细胞极性在HepG2细胞开始形成的时间为96h,在过表达HNF4α的HepG2细胞为72h,低表达HNF4α的HepG2细胞在观察的120h内则不形成极性。在过表达HNF4α加速HepG2细胞极性形成的过程中,伴随着紧密连接蛋白-1、细胞骨架蛋白F-actin和黏附连接蛋白E-cadherin的mRNA和蛋白表达水平的显著升高。过表达HNF4α可逆转由TGFβ1诱导的小鼠正常肝细胞AML12的间质细胞标志分子Vimentin、TGFβ1、α-SMA mRNA的表达水平显著上升,以及上皮细胞标志分子E-cadherin、白蛋白、K18 mRNA的表达水平显著降低。结论:血清中K19及其片段CYFRA21-1的水平优于K18-M65、K18-M30、ALT和AST能够更好地预测肝组织DR和纤维化的发生,提示血清中K19及其片段CYFRA21-1有望成为预测肝脏疾病中DR和纤维化发生发展无创评估的有效指标。另外,低表达HNF4α可能通过加速肝细胞极性的破坏和表型的改变,从而促进肝细胞的胆管上皮细胞化生,为DR发生提供细胞来源,从而促进肝纤维化的发生发展。