目的:随着人类工业活动的增加,环境中重金属污染问题日益受到广泛关注和高度重视。该污染具有持久性、蓄积性和不可逆性,对环境可产生长期而深远的影响,严重威胁人类健康。环境中常见的铅(Pb2+)、汞(Hg2+)等重金属离子含量监测一直是重金属污染综合治理的管控重点。在传统检测重金属离子的方法基础上,利用新材料不断加强研发快速精准检测新方法是环境健康领域科技创新驱动发展的机遇和挑战,对于防控重金属污染具有重要意义。核酸探针具有实时、直观、便捷和灵敏等分析检测的优势,在生物医学、环境和食品等众多领域的分析检测中应用广泛,发展前景广阔。将具有高特异性的功能性核酸作为传感元件,构建设计探针,用于重金属离子检测,可展示良好的性能。因此,本研究以两种功能核酸-金属离子特异性碱基对(T-Hg2+-T)和脱氧核酶（DNAzyme）为基础,联合新型微纳米材料分别设计和构建针对Hg2+和Pb2+的核酸探针传感器,并探索该探针在环境中或细胞内的检测应用性能,为实现快速、灵敏、可视化的重金属离子识别与检测提供新的策略,为重金属离子监测技术研发提供新的思路。方法:1.基于T-Hg2+-T特异性碱基对,联合金纳米棒（Au NRs）和金属-聚多巴胺框架@三联吡啶钌(MPFs@Ru（dcbpy）32+)的Hg2+双模式检测新方法研究（1）Au NRs与MPFs@Ru（dcbpy）32+的制备与表征首先以氯金酸（HAu Cl4）为原料通过典型的种子介导的生长过程制备和纯化具有均一尺寸的Au NRs。采用扫描电子显微镜、透射电子显微镜、紫外可见光谱技术等进行表征研究Au NRs的粒径大小、形态等。其次,通过简单的一步法,以硝酸锌（Zn（NO3）2·6H2O）和二甲基咪唑（2-MI）为原料合成金属有机框架ZIF-8。然后,再以ZIF-8为模板,合成具有丰富的π电子的空心金属-聚多巴胺框架（MPFs）。三联吡啶钌可以通过π-π堆积反应,从而修饰在MPF上形成MPFs@Ru（dcbpy）32+复合物。采用红外光谱、扫描电子显微镜、透射电子显微镜、X射线光电子能谱分析、紫外可见光谱技术等表征MPFs@Ru（dcbpy）32+复合材料的形态结构、化学元素和特征吸收峰的变化情况。（2）DNA1包被磁珠（MBs-DNA1）和碱性磷酸酶缀合DNA2（ALP-DNA2）探针的制备设计生物素标记的富含T碱基的DNA1和DNA2,通过亲和素与生物素间的特异性结合作用分别与亲和素修饰的MBs和ALP连接,分别制备MBs-DNA1和ALP-DNA2探针,作为识别Hg2+的传感元件。（3）双模式传感分析检测可行性验证ALP可水解抗坏血酸磷酸酯（AAP）产生抗坏血酸（AA）。在电致化学发光（ECL）传感分析平台中,采用ECL技术对MPFs@Ru/S2O82-系统的发光机制以及AA猝灭发光信号机制进行研究。在比色传感分析平台中,酶水解产物AA可用作还原剂,将硝酸银还原成银单体,原位沉积在Au NRs上形成Au NRs@Ag。为了证明银沉积在Au NRs上的可行性,设计对照实验通过肉眼观察反应溶液颜色变化,同时还可以测试局部表面等离子共振（LSPR）峰值变化来进行分析。采用TEM图验证Ag沉积后Au NRs的形状变化。（4）双模式传感分析平台的响应特性研究首先将准备好的MBs-DNA1,ALP-DNA2和Hg2+利用T-Hg2+-T错配机制进行杂交。磁力分离和洗涤后,将MBs-DNA1/ALP-DNA2复合物加入到96孔板的孔中。加入AAP进行酶催化生成AA的脱磷反应。然后,将孔中的一部分溶液转移至电解池中,进行ECL信号的检测;将另外一部分溶液转移到含有Ag NO3和Au NRs的混合溶液中,利用AA还原在Au NRs上沉积Ag所呈现的颜色变化来进行比色检测。探讨不同的机制和独立的信号转导模式的响应特性。（5）实际环境中样品检测收集一定数量的湖水样品,用本研究设计的双模式传感新方法对水样进行检测,评价本方法应用于实际环境中汞离子检测的可行性。2.基于脱氧核酶（DNAzyme）联合蠕虫状壳核纳米链（Au@PDA NWs）的Pb2+荧光成像检测新方法研究（1）聚多巴胺包裹金纳米粒子形成的蠕虫状壳核纳米链（Au@PDA NWs）的合成及表征首先以柠檬酸盐作为还原剂,动力学控制种子生长合成的方法,合成40 nm左右的金纳米颗粒（Cit-Au NPs）。采用透射显微镜、紫外分光光谱等方法对Cit-Au NPs的形态和性能进行证明和分析。然后以盐酸多巴胺溶液为原料,在p H为碱性的条件下,通过超声反应在金纳米粒子表面聚集为聚多巴胺（PDA）壳,形成壳核状纳米链。通过透射电子显微镜、场发射透射电子显微镜,X射线光电子能谱分析、X射线衍射、紫外分光光谱等技术对Au@PDA NWs的形态、晶体结构、性能进行表征。（2）DNAzyme纳米探针的构建及表征将设计的铅离子特异性DNAzyme加热-冷却后形成发夹状结构DNAzyme（H DNAzyme）,再将其与Au@PDA NWs结合,通过配位作用以及π-π堆积作用,发夹DNAzyme探针成功加载至Au@PDA NWs,形成Au@PDA NWs-H DNAzyme纳米探针。利用Zeta电位分析以及荧光光谱验证探针的构建。（3）构建纳米探针的响应性能验证使用非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳验证核酸探针对铅离子的响应性能,并用凝胶成像系统成像进行分析。利用荧光光谱验证构建纳米探针检测铅离子的可行性,将构建好的纳米探针与不同浓度的铅离子溶液混合,反应一段时间后,离心收集上清液进行荧光测试,观察荧光强度变化,测试设计探针对于溶液中Pb2+的响应性能。（4）细胞及斑马鱼体内Pb2+荧光成像检测分析体外培养Hela细胞,进一步测试纳米探针在该细胞中识别Pb2+的性能。首先通过MTT实验评价纳米载体的细胞毒性。其次将细胞与Pb2+一起孵育后,再递送探针进入细胞,以使其充分摄取。最后使用共聚焦显微镜观察细胞荧光成像。通过设计对照试验,观察荧光强度变化验证纳米探针用于活细胞中的金属离子成像能力。另外,为了进一步证明纳米探针在动物体内对铅离子的成像能力,将该探针与暴露Pb2+的斑马鱼幼鱼共孵育,采用共聚焦显微镜观察并记录探针在幼鱼体内对Pb2+的成像情况。结果:1.基于T-Hg2+-T特异性碱基对,联合金纳米棒（Au NRs）和金属-聚多巴胺框架@三联吡啶钌(MPFs@Ru（dcbpy）32+)的Hg2+双模式检测新方法研究（1）Au NRs与MPFs@Ru（dcbpy）32+的制备与表征透射电镜观察发现Au NRs呈分散、均一的纳米棒状结构,并且材料溶液颜色呈现粉红色。紫外光谱图显示Au NRs在860 nm处存在纵向等离子体共振吸收峰。场发射电子显微镜观察合成的ZIF-8为500 nm左右的纳米立方体结构,经过与盐酸多巴胺的反应后,合成的MPFs表现为表面粗糙的中空状结构,HAADF-STEM图像验证了该结果。同时通过傅里叶红外光谱图、紫外光谱图、X射线能谱图分析对比合成材料的特征吸收峰和元素组成,表明MPFs@Ru（dcbpy）32+合成成功。（2）双模式传感分析检测法的机制验证通过形成T-Hg2+-T碱基对,MBs-DNA1和ALP-DNA2可特异性捕获Hg2+配对为双链体探针。经磁性分离收集的ALP诱导AAP产生AA。ECL分析响应信号明显下降表明AA可以猝灭MPFs@Ru/S2O82-系统的发光信号,推测可能的猝灭机制为AA（H2A）分解产生的HA-会与ECL体系中的Ru（dcbpy）3+或Ru（dcbpy）32+竞争与关键物质SO4·-反应从而减少最终激发态物质,实现猝灭效果。同时在比色传感分析系统中,通过透射电镜结果观察到Au NRs表面包裹着一层薄壳,并伴随粉红色溶液到绿色溶液的颜色变化,紫外可见光谱发现LSPR峰值蓝移,这些结果都证明了AA可以还原Ag NO3在Au NRs上沉积银壳。（3）双模式传感分析的响应性能验证对影响实验的重要条件进行了优化,包括K2S2O8的浓度、检测溶液的p H值、T-Hg2+-T反应的孵育时间和ALP的水解时间。发现K2S2O8的最佳浓度为100 mmol L-1,最适p H为8,T-Hg2+-T的最佳反应时间为60 min,ALP的最佳水解时间为20 min。在此最优的实验条件下,对不同浓度的汞离子进行了检测分析,通过肉眼即可观察到随着Hg2+浓度的增大,反应溶液呈现粉色到橙色、黄色、青色、绿色、和墨绿色的多色变化。双传感分析测定信号响应值与Hg2+的浓度在2 pmol L-1至500 nmol L-1的范围内成良好的线性关系,检测限低至0.32 pmol L-1。该方法表现出良好的选择性、稳定性和重现性。同时,使用智能手机应用程序Color Picker获取的分析数据,证实了R/G值随着Hg2+浓度的增加而降低,表明R/G值可以作为Hg2+定量的参数,并呈现良好的线性相关,表明本方法可使用智能手机便携式检测Hg2+。（4）实际环境中样品检测研究基于ECL传感分析测定湖水加标样品的回收率为98.53%至111.97%,比色法为95.04%至106.11%,表明该方法有潜力应用于实际环境水样方面中现场即时检测Hg2+。2.基于脱氧核酶（DNAzyme）联合蠕虫状壳核纳米链（Au@PDA NWs）的Pb2+荧光成像检测新方法研究（1）Au@PDA NWs的制备与表征紫外分光光谱分析发现存在800 nm左右的吸收峰,表明Au@PDA NWs能有效吸收近红外光。利用透射电镜可以观察到Au@PDA NWs由PDA壳包裹4到5个金纳米粒子核心组成,Au@PDA NWs的平均长度尺寸约为200 nm。元素映射图谱有效验证了其壳核结构的存在。傅里叶红外光谱、X射线光电子能谱分析、X射线衍射图谱验证了Au@PDA NWs的元素组成,结果表明Au@PDA NWs合成成功。（2）Au@PDA NWs-H DNAzyme探针的响应机制验证聚丙烯酰胺凝胶电泳成像观察到设计的H DNAzyme对Pb2+的响应切割效率,随着反应时间的增加,切割反应效率逐渐增强,30 min左右达到饱和。同时H DNAzyme对不同浓度铅离子（50 n M-100μM）的响应效率,随着铅离子浓度增加,裂解反应逐渐增强,证实裂解反应具有浓度依赖性。以上结果均表明H DNAzyme对Pb2+具有优异的催化活性,可有效介导裂解反应发生。而后通过Zeta电位负向变化证实了发夹DNAzyme可有效加载至Au@PDA NWs,表明成功构建Au@PDA NWs-H DNAzyme探针。使用荧光光谱验证Au@PDA NWs-H DNAzyme探针对Pb2+的响应,发现收集的上清液荧光信号增强,表明构建探针可在Pb2+存在下,实现荧光信号“开启”的响应策略。（3）设计探针体外传感响应性能验证优化了三个重要实验条件—H DNAzyme与Au@PDA NWs共孵育的固定时间、缓冲液Ca2+的浓度以及探针与Pb2+溶液的孵育时间。选择60 min作为最佳孵育固定时间,得到缓冲液Ca2+的最优浓度为6 m M和与Pb2+溶液的最佳孵育反应时间为30 min。在最优的实验条件下,对不同浓度的铅离子进行了检测分析。构建探针的荧光响应信号值与Pb2+浓度在0.01-20 n M范围内呈线性相关,可有效用于体外灵敏检测Pb2+,并展现出良好的选择性。（4）细胞及斑马鱼幼鱼体内铅离子的荧光成像检测细胞毒性实验结果表明Au@PDA NWs具有良好的生物相容性和低毒性。我们优化了纳米探针的细胞摄取时间,选择3 h作为最优摄取时间。激光共聚焦荧光检测显示,Au@PDA NWs-H DNAzyme可有效进入细胞内环境,并未观察到明显背景荧光。对Hela细胞进行不同浓度（100 n M、500 n M、5μM）的Pb2+暴露后,再使用纳米探针进行成像检测分析,发现红色荧光强度随着Pb2+浓度的增加而增强。以上结果表明Au@PDA NWs-H DNAzyme纳米探针可用于对活细胞中的Pb2+进行成像检测分析。此外,对Pb2+暴露的受精后五天（5 dpf）的斑马鱼幼鱼进行纳米探针体内成像观察,发现与对照组相比,Pb2+处理组的荧光强度增强,且观察到红色荧光有蓄积现象,提示该探针亦具有用于动物体内Pb2+成像检测的潜力。结论:本研究利用功能核酸探针,使用不同的新型材料,基于三种传感分析技术（比色法、ECL法以及荧光法）,分别实现了对两种常见重金属离子Hg2+的双模式检测和Pb2+的成像检测。设计的Hg2+双模式检测新方法有效地联合了两种传感模式,可快速准确检测Hg2+。同时,结合智能手机与多色分析法,通过商业化APP实现了更便捷的现场即时可视化检测Hg2+,达到了对水环境中重金属Hg2+污染离子既能定性又能定量的检测目标。设计的Pb2+荧光成像检测新方法,能清晰显示细胞或动物（斑马幼鱼）Pb2+暴露后探针的成像情况,具有进一步实现体内传感检测应用的潜在价值。总之,本研究为促进发展环境中重金属污染的现场即时检测以及重金属在细胞内可视化成像检测的技术创新研发提供了可行的策略,为更好地防控重金属污染提供了实验依据。