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前言:胶质瘤是最常见的原发性颅内恶性肿瘤,因其高度的侵袭性及恶性增殖能力,胶质瘤的复发率和死亡率居高不下,尤其是胶质母细胞瘤(Glioblastoma multiforme,GBM)。即使采用手术最大程度切除联合放化疗的标准化治疗方案,治疗效果仍不尽如人意。近年来,越来越多的研究开始关注恶性肿瘤细胞与其所在的微环境间的相互调控与相互适应,来自肿瘤细胞外的各种信号往往使肿瘤细胞内部处于高度应激状态,如线粒体应激或内质网应激,这种应激状态可使肿瘤细胞发生自噬凋亡从而起到杀伤肿瘤的效果,但是很快便产生耐药或治疗抵抗,很大程度上是因为肿瘤细胞高度的可塑性和自适应能力使其在这种应激状态下存活下来并将其转化为促进自我更新的动力,胶质瘤亦是如此。鉴定胶质瘤内部应激相关信号靶点及调控机制对理解胶质瘤细胞在应激状态下的适应现象、开发相关靶向疗法具有重要科学意义和临床价值。在本项研究中,我们在胶质瘤公共数据库中建立了个体化的内质网应激风险评分,发现该风险评分同胶质瘤不良预后及恶性分子亚型、生物学功能密切相关。随后我们筛选鉴定到可代表该风险评分的核心基因DERL3,并在模型中证实了DERL3作为内质网应激效应分子,参与了对胶质瘤细胞恶性增殖侵袭等行为的调控,并阐明了这种调控效应依赖于DERL3结合HNRNPA2B1并维持后者稳定性进而激活NF-κB通路的深入分子机制。研究方法:(1)数据库与临床组织样本:从CGGA(Chinese Glioma Genome Atlas)、TCGA(The Cancer Genome Atlas)二个平台获取胶质瘤患者的表达谱及相应临床信息,选取CGGA平台作为内部发现数据集,选取TCGA数据平台作为外部验证数据库。在患者及家属知情同意的情况下,患者的临床标本由中国医科大学附属第一医院手术获得,相应实验同时已通过本单位伦理委员会的审核及批准。(2)生物信息学分析方法:通过基因本体论(GO)分析和KEGG分析方法对不同组间差异基因进行生物学功能注释和基因分子通路注释;使用基因集富集分析(GSEA)软件对不同组间差异基因进行功能和通路富集分析;应用单因素COX回归分析对纳入的基因或不同分组进行生存分析,通过多因素COX回归分析探究单因素生存分析中的独立预后因素;利用ROC对多因素COX中的独立预后因素进行分析,验证模型的预测预后的价值。(3)细胞系模型:U87、LN229和U251人源胶质瘤细胞系均购买自中国科学院上海细胞库,正常人类星形胶质细胞株NHA由中国北京神经外科研究所江涛教授赠与。GSC21和GSC40神经球来自于本实验室团队构建的患者来源的胶质瘤原代细胞株。根据中国医科大学附属第一医院伦理委员会批准的方案,用中国医科大学附属第一医院神经外科手术过程中的实时切除的新鲜临床胶质瘤标本提取原代细胞。(4)分子生物学实验:用q PCR、Western Blot和免疫组化等实验检测分子表达水平;利用免疫共沉淀及液相色谱质谱技术寻找与目的蛋白存在结合的潜在受体蛋白;应用MTS测定检测胶质瘤细胞的增殖能力;应用Transwell实验检测胶质瘤细胞的侵袭及迁移能力;体内实验采用裸鼠原位移植瘤模型,用于表型的进一步验证。(5)统计学分析:组间差异分别通过双尾t检验和单因素方差分析(ANOVA)以及卡方检验确定;绘制Kaplan-Meier生存曲线并进行Log-rank检验比较不同患者组的生存差异;应用COX回归分析鉴定独立预后因素;Pearson检验用于相关性分析。Graph Pad Prism 8、R 3.6.1和SPSS等软件完成上述相关分析;双尾P<0.05认为有统计学差异。结果:第一部分:胶质瘤中内质网应激状态的临床价值描绘以及核心靶点DERL3的鉴定首先,我们汇总了内质网应激相关基因集,并基于CGGA和TCGA胶质瘤大样本数据库基因表达信息及临床信息,通过COX预后基因筛选的方法,鉴定到7个与胶质瘤生存相关的内质网应激基因,基于这7个基因我们构建了个体化的胶质瘤内质网应激相关风险评分,我们发现该风险评分同胶质瘤患者的病理级别呈正相关,并且IDH1野生型患者中该风险评分显著高于IDH1突变型胶质瘤患者,间质分子亚型的胶质瘤患者亦伴有更高的内质网应激风险评分,生存分析提示高内质网应激风险评分伴随较短的生存时间。进一步多因素COX分析我们鉴定到内质网应激相关基因中的核心基因DERL3,其可作为稳定的内质网应激风险评分的标记,并且DERL3的表达水平同胶质瘤病理级别、IDH1及分子亚型等特征密切相关,高表达DERL3的胶质瘤患者生存时间显著缩短,提示DERL3可能作为胶质瘤中内质网应激相关的一个潜在的标记基因和调控靶点。随后通过免疫组化及Western Blot等常规分子生物学技术手段我们解析了DERL3在胶质瘤患者及相关细胞模型中的表达模式,证实了DERL3同胶质瘤的恶性程度呈正相关,为下一步探究DERL3在胶质瘤的恶性进展中是否发挥调控作用奠定了基础。第二部分:DERL3可促进胶质瘤细胞恶性进展并受内质网应激通路调控在第一部分中,我们在胶质瘤大样本库中描绘了内质网应激相关风险评分的临床价值,并鉴定到相关核心分子DERL3,基于前期实验结果,我们选择U87和LN229两株胶质瘤细胞系进行了后续的分子生物学实验。首先我们分别构建了DERL3慢病毒敲减和质粒载体过表达的稳转细胞系,后续的功能表型实验结果显示,DERL3敲低可显著抑制胶质瘤细胞的恶性增殖、侵袭及颅内成瘤能力,相反,DERL3过表达在一定程度上促进了胶质瘤细胞的恶性增殖及侵袭等不良行为,提示了DERL3在调控胶质瘤恶性进展中的关键介导作用。为了探究DERL3同内质网应激状态之间的调控关系,我们开展了一系列相关的分子生物学实验进行论证。首先,干预DERL3的表达并未改变胶质瘤细胞的内质网应激状态,ATF6、Bi P等相关激活标记的表达未受明显影响。相反,当激活或抑制胶质瘤细胞的内质网应激状态时,DERL3的表达同内质网应激相关标记变化一致,说明DERL3的表达受胶质瘤细胞内质网应激状态调控,其亦可作为新的内质网应激激活标志分子。与此同时,我们发现内质网应激状态激活后胶质瘤细胞恶性行为学能力增强,而敲低DERL3可显著削弱内质网应激激活所造成的这种促癌效应,提示了内质网应激状态促进胶质瘤细胞恶性进展部分依赖于DERL3的介导。以上结果证实了DERL3在内质网应激促胶质瘤恶性进展中的重要介导作用,其可能作为较好的胶质瘤应激相关调控靶点。第三部分:DERL3-HNRNPA2B1信号轴通过激活NF-κB通路进而影响胶质瘤细胞恶性进展的机制研究为了深入探究DERL3发挥促胶质瘤恶性进展的分子机制,我们首先在数据库层面根据DERL3的表达量分组筛选差异基因,并进行相应的富集分析,富集分析结果提示DERL3的高表达同NF-κB通路激活相关;随后我们在先前建立的DERL3敲低及过表达细胞模型中证实了干预DERL3的表达确实可相应抑制或激活NF-κB通路;通过回复实验我们进一步证实了DERL3促进胶质瘤细胞恶性进展需要依赖于NF-κB通路的激活。为了进一步阐述DERL3激活NF-κB通路的深入分子机制,我们进行了DERL3的免疫共沉淀试验并进行质谱检测,在质谱分析结果中筛选到结合特异性较好的HNRNPA2B1分子,且有文献报道HNRNPA2B1对NF-κB通路的激活具有调控效应。随后我们通过Co-IP实验结合WB证实了二者的结合关系,并发现二者结合后DERL3增加了HNRNPA2B1的蛋白稳定性,使其蛋白酶体途径降解减少,明确了DERL3对HNRNPA2B1的转录后调控机制。最后我们通过一系列回复实验,证实了DERL3通过HNRNPA2B1的介导,激活了胶质瘤细胞的NF-κB通路,进而促进胶质瘤恶性进展。结论:第一部分:我们建立的内质网应激风险评分可作为判断GBM患者生存状态及不良分子事件的重要标记;DERL3可作为可靠的内质网应激相关核心代表分子及胶质瘤恶性标记分子。第二部分:DERL3在胶质瘤细胞中具有调控功能,干预DERL3可显著削弱胶质瘤的恶性进展;DERL3可作为稳定的内质网应激激活标志分子,其介导了内质网应激状态对胶质瘤细胞恶性行为学的促进效应。第三部分:DERL3可特异性结合HNRNPA2B1分子,并以转录后调控的机制,维持HNRNPA2B1蛋白稳定性,减少其蛋白酶体途径降解从而维持HNRNPA2B1的表达;DERL3-HNRNPA2B1信号轴通过NF-κB通路起到促进胶质瘤的恶性进展。靶向DERL3-HNRNPA2B1-NF-κB信号轴将为胶质瘤的靶向治疗提供新的思路和方向,具有重要的科学价值和临床意义。