玉米抗大斑病相关基因表达片段的分离和克隆

来源 :河北农业大学 | 被引量 : 3次 | 上传用户:doto
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以含有抗大斑病不同主效抗病基因的玉米自交系(B37、B37Ht1、B37Ht2)为材料,利用DDRT-PCR技术对接种玉米大斑病菌(0号小种和1号小种)后玉米叶片早期表达基因进行分析,以明确亲和性互作与非亲和性互作中差异表达基因的数目,并对可能与抗病性有关的差异表达片段进行回收、克隆和测序,为建立玉米抗大斑病表达序列标签并最终克隆这些基因,研究其功能奠定基础。 研究所获主要结果如下: 1、建立了适合玉米叶片mRNA差异显示的技术体系 (1)UNIQ-10柱式Trizol总RNA抽提试剂盒提取玉米叶片总RNA,反转录合成的cDNA在300bp-2000bp,适合于DDRT-PCR扩增。 (2)两步扩增法的PAGE检测结果优于一步扩增法,带型清晰,条带数量也较多,每对引物可获得扩增条带40-60条,大小为150-1000bp。 2、用12个随机引物、3个锚定引物组成的36个引物组合对接种(0号、1号小种)后的玉米叶片进行DDRT-PCR扩增,经PAGE电泳和银染检测,共获得差异显示片段148条,对其进行回收,二次扩增后,经1.2%琼脂糖电泳检测,发现138条能再次产生扩增条带,差异片段回收率达93.2%。 3、经反式Northern杂交检测,共获得阳性片段63条,阳性率为42.6%。亲和性互作中特异表达的基因片段为24条(其中可能与B37对0号小种感病有关的片段17条,可能与B37Ht1对1号小种感病性有关的片段7条);而非亲和性互作中,特异表达的基因片段为21条(其中可能与B37Ht1、B37Ht2对0号小种抗病性有关的片段为16条,可能与B37Ht2对1号小种抗病性有关的片段5条)。 4、对特异于B37Ht2的5条基因片段克隆、测序、同源性分析表明,它们与某些植物、细菌、动物中氧化还原酶、合成酶、激素受体蛋白、转录调节因子、膜转运蛋白等有一定的同源性。对于这些片段的功能还需进一步获得基因全长和通过功能互补实验才能确定。
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