【摘 要】
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多种病毒性病原可直接作用于卵巢、胎盘、胚胎和胎儿,或间接诱发高热或促炎性细胞因子的高表达,从而引发卵巢功能障碍、流产、产死胎或宫内发育迟缓等多种母猪繁殖障碍疾病。猪伪狂犬病（Pseudorabies）是由猪伪狂犬病毒（Pseudorabies virus,PRV）引起的急性、发热性传染病,可通过精液带毒、胎盘垂直传播或宫内感染多种途径造成感染,导致母猪严重的繁殖障碍。虽已明确PRV可感染母猪卵巢组
【基金项目】
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国家自然科学基金项目（编号:31772819和31972761）；
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多种病毒性病原可直接作用于卵巢、胎盘、胚胎和胎儿,或间接诱发高热或促炎性细胞因子的高表达,从而引发卵巢功能障碍、流产、产死胎或宫内发育迟缓等多种母猪繁殖障碍疾病。猪伪狂犬病（Pseudorabies）是由猪伪狂犬病毒（Pseudorabies virus,PRV）引起的急性、发热性传染病,可通过精液带毒、胎盘垂直传播或宫内感染多种途径造成感染,导致母猪严重的繁殖障碍。虽已明确PRV可感染母猪卵巢组织,但如何突破“血-卵屏障”引起母猪繁殖障碍的作用机制尚不清楚。猪卵巢颗粒细胞（Granulosa cells,GCs）作为卵巢中的最大细胞群体,在卵泡发育的进程中发挥着重要作用。PRV是否通过感染猪卵巢GCs,影响其细胞功能从而导致母猪繁殖障碍尚不清楚。因此,在本论文研究中,主要利用原代培养的猪卵巢GCs为模型,通过体外感染研究PRV感染对细胞增殖、凋亡及激素分泌等的影响,并初步探讨其可能的作用机制。本研究采用细胞间接免疫荧光（IFA）鉴定了分离的猪原代卵巢GCs,结果显示分离的GCs呈FSHR阳性,其纯度较高且无PRV和PCV2的感染。用PK-15细胞扩繁PRV(10-5TCID50/0.1 m L)后,通过不同的病毒滴度病毒感染GCs,显微镜下可观察细胞发生不同程度的细胞病变（CPE）,且呈滴度和时间依赖;采用实时荧光定量PCR和IFA检测发现,用不同病毒滴度感染GCs后,PRV g E的表达在感染24 h后急剧增加（P＜0.01）,且病毒主要定位在GCs的细胞核中。MTS和流式细胞术分别检测发现,PRV感染可显著抑制猪卵巢GCs的增殖（P＜0.05）,影响细胞周期的进程,使细胞阻滞在S期;进一步检测发现,用PRV感染GCs后,细胞中增殖蛋白Ki67的表达显著下降（P＜0.05）,并下调S期相关基因（包括CDK2、CCNE1、CCNA1和CCNB1）的表达（P＜0.05）。此外,在PRV感染GCs后,可下调ERK1/2蛋白的表达,诱导其磷酸化水平的提高（P＜0.05）。进一步通过TUNEL染色、流式细胞术和蛋白免疫印迹（Western Blot）检测了PRV对猪卵巢GCs凋亡的影响,结果显示,PRV感染可显著促进卵巢GCs的凋亡,并诱导促凋亡蛋白Bax的上调,同时也上调Caspase-9及其剪切体的水平以及Caspase-3的水平（P＜0.05）。最后,采用放射免疫（RIA）和ELISA法分别检测了PRV感染对猪卵巢GCs中生殖内分泌激素分泌的影响,结果显示:PRV可抑制卵巢GCs中雌激素（E2）和孕酮（P4）的分泌,使GCs中细胞因子,包括抑制素B（INH-B）和卵泡抑素（FS）的水平上升（P＜0.05）;同时下调参与E2和P4合成的关键基因（CYP19A1、17β-HSD、3β-HSD、St AR和CYP11A1）的表达（P＜0.05）。本研究结果表明,PRV可感染猪卵巢GCs,影响细胞的增殖和细胞周期进程,同时可促进GCs的凋亡并影响细胞激素的分泌;PRV对卵巢GCs功能的影响可能通过调控MAPK通路和线粒体途径实现。
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