研究背景与目的糖尿病肾病(diabetic ncphrophthy, DN)是糖尿病(diabetes mellitus, DM)危害性最大的慢性并发症之一。DN病理改变的特征是细胞外基质(extracellular matrix, ECM)成分积聚所致的肾小球肥大、基底膜增厚、系膜基质增宽,最后发展为肾小球硬化。在外界刺激下,系膜细胞会迅速发生表形变化,并可分泌多种生长因子,如血小板衍生因子、胰岛素样生长因子、成纤维细胞生长因子,单核细胞趋化因子(monocyte chemoattractant protein-1, MCP-1).这些炎症因子能够招募炎症细胞,增加细胞外基质积聚,其中MCP-1起到了关键的作用,被认为是肾疾病发病机理的一种主要趋化因子。DN的发病机制目前尚不完全清楚,在导致DN的众多原因中,现普遍认为氧化应激是造成糖尿病肾病各种损害的主要原因。晚期氧化蛋白产物(advanced oxidation protein products, AoPPs)是Witko. Sarsat在慢性肾功能衰竭(chronic renal failure, CRF)病人血浆中发现的蛋白质氧化交联产物。它是由中性粒细胞髓过氧化物酶催化活性氧生成的次氯酸作用于蛋白质而形成的。AoPPs主要在CRF患者中出现,不过有学者证实了在糖尿病患者血液中也有AOPPs的升高,同时发现肥胖患者也存在AOPPs升高,这表明AOPPs可能参与了糖尿病肾病的形成。最近有研究表明,AOPPs能够通过活化蛋白激酶C后通过NADPH氧化酶诱导系膜细胞产生活性氧(reactive oxygen species, ROS),促使系膜细胞产生氧化应激反应。丝裂原活化蛋白激酶(mitogen activated protein kinases, MAPKs)、核转录因子(nuclear factor, NF-κB)等是氧化应激敏感的信号,主要参与细胞增殖、分化、转化及凋亡的调节,与炎症性疾病的发生机制密切相关,可促使肾内炎症反应。小白菊内酯(parthenolide, PTL)是从feverfew (Tanacetum parthenium)纯化出的一种倍半萜烯内酯类化合物,是被证实为药理活性最好的成分。它曾被用于治疗发热、偏头痛、哮喘及关节痛等。而它的功效远不止这些,很多实验表明小白菊内酯是一种特异且强有效NF-κB抑制剂,通过直接阻止NF-κB和(或)作用于IKK复合体,表现出强大的抗氧化、炎症、肿瘤作用。在这个实验中,我们以PTL等化合物为原料合成了一系列倍半萜烯内酯类化合物,研究了其构-效关系。本研究以体外的系膜细胞为对象,观察人工合成的晚期蛋白氧化产物是否能够激活MAPKs/NF-κB信号通路和上调炎症因子MCP-1的表达,以及被激活的NF-κB和MCP-1能否被倍半萜烯内酯类化合物抑制,更重要的是通过与小白菊内酯比较观察我们研制的倍半萜烯内酯类化合物的药效。研究内容与方法1、AOPPs的制备将20mg/ml大鼠白蛋白与40mmo/1次氯酸等体积混合,室温放置30分钟,其摩尔比为1：140(RSA-次氯酸)。制备的AOPP在无内毒素PBS中透析24小时,除去游离的次氯酸。用0.22μm的微孔滤膜过滤除菌后4℃保存。20mg/mlRSA与PBS等体积混合,作为对照。AOPPs含量通过测定酸性条件下340nm的吸光度,以氯胺T为标准取得。通过鲎试验法检测,该方法制备的AOPPs内毒素含量均低于0.25EU/m1。2、大鼠系膜细胞的培养大鼠肾小球系膜细胞(HYBZ-1)购自武汉细胞库。细胞复苏后在37℃、5%C02条件下用含10%胎牛血清的低糖DMEM培养基中培养,待细胞生长至70-80%融合时用于实验。3、AOPPs对细胞单核细胞趋化蛋白-1(MCP-1)的影响MCs生长至融合,分别与浓度为0、50、100、200(μg/ml)的AOPPs和200(μg/ml)未经修饰的RSA共同孵育,于24小时后收集细胞上清。ELISA法检测MCP-1在细胞上清中的浓度。4、AOPPs对单核细胞趋化蛋白-1mRNA(MCP-1mRNA)表达的影响MCs分别与浓度为0、50、100、200(μg/ml)的AOPPs或200(μg/ml)未经修饰的RSA共同孵育24小时后,收集细胞,加入Trizol试剂提取细胞总RNA。按试剂盒说明进行操作,RT-PCR测定MCP-1mRNA表达。5、AOPPs对细胞内p47phox的膜迁移的影响MCs分别与浓度为0、50、100、200(μg/ml)的AOPPs或200(μg/ml)未经修饰的RSA共同孵育1小时后,收集细胞,提取细胞浆和细胞膜蛋白。按试剂盒说明进行操作,Western blot检测每组细胞浆内p47phox蛋白的表达和膜内p47phox蛋白的表达。6、AOPPs对细胞内MAPKs信号通路的影响MCs分别与浓度为0、50、100、200(μg/ml)的AOPPs或200(μg/ml)未经修饰的RSA共同孵育1小时后,收集细胞,提取细胞总蛋白。按试剂盒说明进行操作,Western blot检测每组细胞内p-P38、P38、p-JNK、JNK、p-ERK1/2、 ERK1/2蛋白的表达。7、AOPPs对细胞内NF-κB信号通路的影响MCs分别与浓度为0、50、100、200(μg/ml)的AOPPs或200(μg/ml)未经修饰的RSA共同孵育1小时后,收集细胞,提取细胞总蛋白和细胞核蛋白。按试剂盒说明进行操作,Western blot检测每组细胞内NF-κB/p65、p-IκBa、 IκBa、p-IKK a、IKK a蛋白的表达和核内p-NF-κB/p65蛋白的表达。8、倍半萜烯内酯类化合物对AOPPs诱导的细胞MCP-1的影响浓度为10(μmol/L)的倍半萜烯内酯类化合物与MCs孵育1小时后,浓度为200(μg/ml)的AOPPs刺激24小时后收集细胞上清。ELISA法检测MCP-1在细胞上清中的浓度。9、倍半萜烯内酯类化合物对AOPPs诱导的细胞MCP-1mRNA的影响浓度为10(μmol/L)的倍半萜烯内酯类化合物与MCs孵育1小时后,浓度为200(μg/ml)的AOPPs刺激24小时后,收集细胞,加入Trizol试剂提取细胞总RNA。按试剂盒说明进行操作,RT-PCR测定MCP-1mRNA的表达。10、倍半萜烯内酯类化合物对AOPPs诱导的细胞内NF-κB信号通路激活的影响浓度分别为5、10(μmol/L)的倍半萜烯内酯类化合物与MCs孵育1小时后,浓度为200(μg/ml)的AOPPs刺激1小时后,收集细胞,提取细胞总蛋白。按试剂盒说明进行操作,Western blot检测每组细胞内IκBα蛋白的表达。统计方法所有数据均代表3次重复实验的结果,以均数加减标准差表示。所有统计由统计软件SPSS13.0完成。多个样本均数的比较采用One Way ANOVA,两两比较采用LSD和SNK,P<0.05为差异有统计学意义。结果1、AOPPs的鉴定制备的次氯酸修饰的大鼠血清白蛋白和未经修饰的大鼠血清白蛋白的蛋白浓度分别为8.52mg/ml和10.3mg/ml,AOPPs含量分别为538.14μmol/1and1.56μmol/l,经蛋白浓度矫正后分别为63.16nmol/mg蛋白和0.15nmol/mg蛋白。所有制各的AOPP或未经修饰的RSA经鲎试验法检测内毒素含量均低于0.25EU/ml。2、AOPPs对系膜细胞MCP-1的影响1)AOPPs对大鼠系膜细胞MCP-1蛋白分泌的影响浓度为100、200(μg/ml)的AOPPs与RMCs共同孵育24h时后,细胞上清中分泌的MCP-1含量上调,并且随着AOPPs剂量的增加,上述蛋白表达亦逐渐增加(p<0.05),未经修饰的RSA对MCP-1的分泌无明显影响(p>0.05)。DAOPPs对细胞细胞MCP-1mRNA表达的影响浓度为50、100、200(u g/ml)的AOPPs与RMCs共同孵育24h时后,细胞内的MCP-1mRNA表达上调,并且AOPPs以剂量依赖的方式上调(p<0.05)。未被修饰的RSA对RMCs表达MCP-1mRNA无明显影响(p>0.05)。3、AOPPs诱导细胞内p47phox的膜迁移浓度为50、100、200(μg/ml)的AOPPs与RMCs共同孵育1h时后,细胞浆内的p47phox随着AOPP的浓度逐渐上升而下降(p<0.05),细胞膜内的p47phox随着AOPPs的浓度逐渐上升而升高(p<0.05)。未被修饰的RSA对RMCs内p47phox的膜迁移无明显影响(p>0.05)。4、AOPPs对细胞内MAPKs信号通路的激活浓度为50、100、200(ug/ml)的AOPPs与RMCs共同孵育1h时后,细胞内的磷酸化P38、JNK和ERK1/2的表达量随着AOPPs的浓度逐渐上升而升高(p<0.05),而细胞内总的P38、JNK和ERK1/2的蛋白表达量不变。未被修饰的RSA对RMCs内P38、JNK和ERK1/2的磷酸化表达量无明显变化。5、AOPPs对细胞内NF-κB信号通路的激活浓度为50、100、200(u g/ml)的AOPPs与RMCs共同孵育1h时后,细胞内的磷酸化IκBα、磷酸化IKK a蛋白的表达和核内p-NF-κB/p65蛋白表达量随着AOPPs的浓度逐渐上升而升高(p<0.05),而细胞内总的IKK α、NF-κ B/p65的蛋白表达量不变,总的IκBα随着AOPPs的浓度逐渐上升而被降解(p<0.05),未被修饰的RSA对RMCs内IκBα、IKKα、NF-κB/p65的磷酸化表达量无明显变化。6、倍半萜烯内酯类化合物抑制AOPPs诱导的MCP-1浓度为10(μmol/L)的倍半萜烯内酯类化合物与MCs孵育1小时后,AOPPs200(μg/ml)刺激24小时,Elisa检测细胞上清MCP-1的表达量,细胞上清中分泌的MCP-1含量明显下调(p<0.05)。7、倍半萜烯内酯类化合物抑制AOPPs诱导的细胞MCP-1mRNA浓度为10(μmol/L)的倍半萜烯内酯类化合物与MCs孵育1小时后,浓度为200(μg/ml)的AOPPs刺激24小时,RT-PCR检测细胞MCP-lmRNA的表达量,细胞内的MCP-1mRNA含量明显下调(p<0.05)。8、倍半萜烯内酯类化合物对AOPPs诱导的细胞内NF-κB信号通路激活的影响浓度为5和10(μmol/L)的倍半萜烯内酯类化合物与MCs孵育1小时后,浓度为200(μg/ml)的AOPPs刺激1小时,Western Blot检测细胞内IκBα蛋白的表达量,细胞内总的IκBα的降解被抑制(p<0.05)。结论AOPPs能够快速诱导大鼠系膜细胞内活性氧的产生,进一步激活了MAPKs/NF-κB信号传导通路,最终导致了MCP-1mRNA和蛋白表达的变化。倍半萜烯内酯类化合物可以全部或部分逆转AOPPs诱导的系膜细胞内IκBα蛋白的泛素化降解和NF-κB的活化,进一步抑制细胞因子MCP-1在系膜细胞内的表达。提示AOPPs对系膜细胞的效应可能在DN发生发展过程中发挥重要作用,而倍半萜烯内酯类化合物对AOPPs诱导炎症的抑制作用可能与抑制NF-κB的活性有关。与PTL相比,自主合成的倍半萜烯内酯类化合物在制备工艺、稳定性、生物利用度、毒副作用等方面均具有显著的优势,显示出了广阔的开发与临床应用前景。