甜菜M14品系碱基切除修复途径中的DNA糖基化酶提取研究

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在全球气候不断变化条件下,农作物生长需要应对各种非生物胁迫(低温,干旱和土壤碱化)条件。非生物胁迫会直接或间接的损伤DNA,因此所有生物都具有DNA修复系统。碱基切除修复(BER)途径是DNA修复系统中的一种重要修复途径,该途径的第一步是由一种特定的酶——DNA糖基化酶引发。近年来,在人、酵母和大肠杆菌中对BER途径已经进行了许多研究,但是在植物中对BER途径的研究报道较少,我们尝试寻找植物中特异的应对DNA损伤的机制。甜菜M14品系是栽培甜菜和野生白花甜菜杂交及回交而获得的单体附加系,富含丰富的优质基因资源,对盐胁迫具有较强的耐受性,是研究逆境胁迫极为难得的材料。实验室前期利用同源序列克隆法,在甜菜M14品系中克隆了DNA糖基化酶基因(Bv M14-Fpg X2)。本研究首先尝试将Bv M14-Fpg X2基因克隆到p LATE31载体中获得重组质粒p LATE31-Bv M14-Fpg X2,并将其转入大肠杆菌XL1Blue中,发现其无法生长,因此将DNA糖基化酶Bv M14-Fpg X2截去其C末端区域含有一段可能影响细胞生长以及细胞表达的DNA序列,获得两个基因剪接体Bv M14-Fpg X2 RKS和Bv M14-Fpg X2 VQA,其中Bv M14-Fpg X2 RKS相比Bv M14-Fpg X2 VQA,留有更多的C端区域。并将其分别构建到p LATE31原核表达载体中,在大肠杆菌BL21(DE3)细胞中进行诱导条件优化,Bv M14-Fpg X2 RKS蛋白未成功进行诱导。对包涵体形式的Bv M14-Fpg X2 VQA重组蛋白进行变性溶解、镍离子亲和层析、洗脱蛋白和复性透析。首次在大肠杆菌原核表达体系中分离纯化了Bv M14-Fpg X2 VQA重组蛋白。本研究为后续研究Bv M14-Fpg X2 VQA对DNA损伤修复功能提供保障,为揭示甜菜M14品系的抗逆性可能与BER修复系统关键酶活性增加的分子机理奠定基础。
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