前言 脊髓损伤后会出现原发性损伤及由其引起的一系列级联放大的迟发性神经坏死而造成的继发性损伤，同时也会出现一系列保护修复性的反应，以减少脊髓损伤并促进脊髓损伤的修复。目前研究发现SCI后，NO／NOS既有损伤作用又有保护作用。NO／NOS对SCI的损伤主要是从神经生化方面加重SCI，而减少脊髓损伤及促进其修复主要是通过血管机制进行的。同时研究发现，cNOS的两个亚型中，nNOS在神经生化方面加重SCI中起重要作用，而eNOS在血管机制方面减轻脊髓损伤及促进修复中起主要作用。而ASCI后两种cNOS如何变化有待进一步研究。本实验旨在研究ASCI后两种cNOS亚型如何变化，及腹腔注射L-Arg对其的影响，为从NO／NOS入手，抑制SCI后的损伤机制，发挥SCI后的保护机制，从而找到治疗SCI的最佳方法奠定基础。 实验材料 一、实验动物及分组 健康纯系Wistar大鼠50只，雌雄不分，体重250～300g，随机分组。 A组：正常对照组5只。 B组：假手术组15只。行单纯椎板切除术，分术后30分、1小时、2小时三个时点，每个时点各为5只。 C组：单纯SCI组15只。进行SCI，分术后30分、1小时、2小时三个时点，每个时点各为5只。 D组：SCI及腹腔注射L-Arg组15只：SCI后立即予以腹腔注射L－A4，Zg／Kg，分术后30分J ／J’时上 ／J’时三个时点，每个时点各为5只。 二、主要试剂 1．兔抗鼠nNOS抗体及eNOS抗体 2．即用型SABC试剂盒及DAB显色试剂盒 3．L－Arg注射液 sg／20Inl 三、主要仪器 1．改良Alien’s打击器（自制） 2．石蜡切片机 3．Olympus BX60光学显微镜，X10手术用显微镜 4．OlympuS／DP10显微数码照相机 5．Olympus C－W95软件，MetaMorph全自动真彩色图像分析仪 实验方法 一、动物模型制备 应用 Alien’s重物打击法造成实验组大鼠胸髓门10）节段中度损伤。致伤能量为舶·cm ；假手术组仅行n 全椎板切除术，不损伤脊髓。 二、标本采集，石蜡切片的制作、HE及免疫组织化学染色 对照组，行椎板切除术后于 X 10手术用显微镜下直接将脊髓标本取出；假手术组，单纯切开椎板后，分别于30分＊小时在 ／J’时H个时点将脊髓标本取出；SCI组，于脊髓损伤后分别于30分。二小时上 ／J’时三个时点取材；SCI＋L－Arg组：脊髓损伤后，立即腹腔注射 L－峋O 入分别于 30分＊小时上小时三个时点取材。上述标本取材后制成石蜡切片，分别行HE染色及免疫组织化学染色＊ 及 eNOS入方法采用 SABC法，应用 DAB染 ·2· 色。 三、标本的观测及实验结果的分析 1．光镜下通过HE染色观察各组脊髓损伤情况。 2．光镜下观察各组n］VOS及eNOS染色，比较各组阳性物质 的分布。 3．图像分析：每组取：5张免疫组化切片，每张切片从前角至 后角各取5个高倍视野进行图像采集及图像分析。测定nNOS及 eNOS阳性反应物的平均灰度值（Aversae a value，AG）与光密 度值门Ptical density，OD人对实验数据进行统计学分析，行方差 分析及 t检验，p＜0．05为有显著性差异。 实验结果 一刀E染色及免疫组化染色结果 二．正常对照组及假手术组 光镜下HE染色见脊髓形态结构正常，灰白质清晰可辨，可见 前角分布有较多的多角形的多极神经元，与周围组织结合紧密。 胞核位于胞体中央，大而圆，着色浅，核仁清晰，大而圆．正常组与 假手术组免疫组化染色可见棕黄色阳性物质沉积，数量较少。 2．脊髓损伤组 ＊损伤后30分钟JE染色见灰质内有片状出血，神经细胞 周围出现间隙，神经元变形不明显，稍有肿胀，胞核稍有偏位，胞核 着色略有加深，仍可见核仁。eNOS染色可见前角神经元细胞浆内 及神经纤维网内有棕黄色阳性反应物质沉积，神经元细胞形态尚 无明显异常改变；nNOS组化染色以可见棕黄色阳性反应物质沉 积，细胞形态尚正常。 2）损伤后二小时：HE染色见灰质内片状出血较30分钟组加 重，神经元变形、肿胀，部分神颖细胞核偏位，着色加深，核固缩。 ·3·洲OS染色可见神经元细胞及纤维网中有棕黄色阳性反应物质沉积，较30分钟组颜色加深，细胞形态发生变化，变形J胀；nNOS组化染色以可见棕黄色阳性反应物质沉积。 3）损伤后2小时丑E染色见出血继续加重，神经元变形肿胀明显，周围间隙加大，胞核偏位明显，可见核固缩，部分细胞可见核碎裂、溶解。nNOS及eNOS染色可见神经元细胞浆内及神经纤维网内有棕黄色阳性反应物质沉积，颜色较30分