QO-58是河北医科大学高通量筛选的一个新化合物,体外实验表明该物质对KCNQ2/3型钾离子通道有良好的开放活性(ED50 0.21μM),KCNQ2/3通道是构成M电流基础,主要分布于神经系统,该通道在神经阈电位附近激活与神经兴奋性密切相关,增强该通道活性可有效抑制神经元过度兴奋性(neuronal hyperexcitability),对治疗癫痫、疼痛等神经精神疾病有效。为证实该药物是否具有抗癫痫作用,我们设计了化学和电惊厥动物模型,观察药物的治疗作用,初步考察了其神经毒性和急性毒性,分析了对脑神经递质的影响,以上研究结果对于进一步药理、毒理试验有重要借鉴意义。第一部分QO-58的抗惊厥,癫痫作用研究目的:观察QO-58对化学和电惊厥动物模型及脑电图的影响,分析其抗癫痫作用。方法:(1)昆明小鼠180只,体重18-22g,随机分6组,每组30只,QO-58分小、中、大三个剂量组(12.5、25、50mg/kg),阳性对照药Retigabine(RTG)分小、大两个剂量组(12.5、25 mg/kg),溶剂对照组给予(DMAC:蓖麻油=1:9)以上各组均灌胃给药。QO-58和溶剂灌胃后12小时(预实验,高效液相色谱法测得小鼠灌胃给予QO-58后,脑组织中12h浓度最高。)RTG灌胃后15min后[8],用YSD-4G药理生理实验多用仪,采用最大电休克法刺激(MES)(参数:频率:50Hz,时间:0.25s,电压100V),测定药物抗强直性惊厥发作百分率(或保护率)。(2)昆明小鼠72只,体重18-22g,随机分6组,每组12只,给药方案同上,采用颈背部皮下注射戊四唑(85mg/kg)方法造癫痫模型,观察发生全身阵挛性癫痫症状的阈值,超过30min记为不发作(不发作的比例为保护率)。(3)SD大鼠4只,体重180-220g,用PTZ制作急性惊厥模型,灌胃给予QO-58 50mg/kg,之后12h腹腔注射戊四唑100mg/kg造模,观察造模前后脑电图的变化。结果:(1)小鼠最大电休克保护率,溶剂组为23.3%,QO-58小、中、大三个剂量组分别为33.3%、50%、73.3%,中、大三个剂量组与溶剂组比较有显著差异(p<0.05、0.01),RTG小、大二个剂量组分别为80%、83.3%与溶剂组比较有显著差异(p<0.01)。(2)小鼠化学致惊模型,溶剂组、QO-58小、中、大三组和RTG小、大二组动物惊厥发作的阈值的中位数分别为:456s、559.5s、697s (p<0.05)、979s(p<0.01)、1438s (p<0.05)、1800s(p<0.01)。0保护率分别为:%、16.7%、25%、41.7% (p<0.05)、50% (p<0.01)、66.7%(p<0.01)。(3)大鼠脑电图,用PTZ造模前后有明显变化,癫痫发作时脑电图出现典型棘波,频率20.20±2.15Hz ,波幅1.26±0.17mV ,经QO-58预治疗的大鼠造模后频率为3.20±0.37 Hz,波幅为0.50±0.04 mV。结论:QO-58灌胃给药,25、50mg/kg对电惊厥及PTZ所致小鼠惊厥有良好的治疗作用,50mg/kg能有效减轻癫痫发作时脑电异常活动。第二部分QO-58的毒性作用研究目的:观察QO-58对整体动物神经肌肉、心脏的影响及不同途径用药动物出现的急性毒性反应,初步评价其安全性。方法:(1)昆明小鼠60只,随机分为5组,每组12只,雌雄各半,分别给予25、50、100、200mg/kg四个剂量QO-58和溶剂,灌胃给药12h后将小鼠放到小动物疲劳机上,记录掉下的只数与溶剂组比较阳性率。(2)按照第一部分脑电图记录试验的手术操作,应用BW-200生理无线遥测系统检测,观察QO-58按照50 mg/kg剂量灌胃给药前后,大鼠心电图的变化。(3)SD大鼠90只,体重160-200g,按性别、体重随机分为15组,每组6只,雄雌各半,分别按照0.25、0.5、1.0、2.0g/kg剂量灌胃、3.75、7.5、15、30mg/kg肌注、7.5、15、30、60mg/kg尾静脉注射三种途径给予QO-58,观察产生的急性毒性反应。结果:(1)旋转实验中25、50、100、200mg/kg的QO-58各组从疲劳机上掉下的阳性率为8.3%、25%、16.7%、25%,分别与溶剂组比较(阳性为8.3%)均没有显著性差异(p<0.05)。(2)50mg/kg的QO-58灌胃后连续观察五天心电图,与药前比较RR,PR,QT,均无显著性差异。(3)QO-58灌胃的最大无毒性反应剂量(NOAEL)在0.5~1.0g/kg之间,最大耐受量(MTD)大于2 g/kg;肌注的NOAEL在15~30mg/kg之间,MTD大于30mg/kg;静注的NOAEL在15~30mg/kg间,最小致死量(MLD)在30~60mg/kg间。结论:QO-58对心脏和神经肌肉无明显毒性。QO-58灌胃、肌注、静注的NOAEL分别为0.5~1.0g/kg、15~30mg/kg、15~30mg/kg,MTD分别为大于2 g/kg、30mg/kg,静注MLD为30~60mg/kg。第三部分QO-58对脑神经递质的影响目的:研究QO-58对脑内谷氨酸(Glu)和γ-氨基丁酸(GABA)释放量的影响,进一步探讨其抗癫痫机制。方法:雄性SD大鼠18只随机分为3组,每组6只,分别灌胃给予25、50mg/kg的QO-58和溶剂。给药前在海马(前囟后5.8mm,右5.0mm,深度3.0mm)位置植入微透析探头,利用脑内微透析技术获取透析液,并用高效液相色谱法进行检测。分别于术后第五天及连续灌胃给药三天进行透析,衍生化后测量脑内Glu和GABA的含量。结果:透析液中Glu和GABA峰形良好,标准曲线分别在0.2～20μmol/L,0.1～10μmol/L范围内线性关系良好,r值均大于0.99。混合氨基酸高、中、低三个浓度的对照品,日内及日间RSD均<15%。混合氨基酸对照品高、中、低三个浓度在室温放置2h,4℃放置一周,3次冷冻—解冻循环均稳定,相对误差RE均在±10%之间,RSD < 15%。海马Glu的释放量在给予QO-58前后没有显著性差异(p>0.05)。QO-58的两个剂量组均可显著增加GABA的释放(p<0.01)。结论:QO-58可显著性提高大鼠海马GABA的释放量。总结1 QO-58对电惊厥及PTZ化学致惊的小鼠模型均有良好的抗癫痫作用。2 QO-58在一定程度上抑制神经元异常放电。3 QO-58对心脏和神经肌肉无明显毒性。4大鼠灌胃:最大无毒性反应剂量(NOAEL)在0.5~1.0g/kg之间,最大耐受量(MTD)大于2 g/kg;QO-58大鼠肌注:最大无毒性反应剂量(NOAEL)在15~30mg/kg之间,最大耐受量(MTD)大于30mg/kg;QO-58大鼠静注:最大无毒性反应剂量(NOAEL)在15~30mg/kg间,最小致死量(MLD)在30~60mg/kg间。5 QO-58可显著性提高大鼠海马GABA的释放量。