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研究目的:动态观察远缘链球菌单菌种生物膜的形成、结构以及胞外多糖在生物膜中的分布,比较不同培养时间和蔗糖浓度下远缘链球菌在生物膜黏附状态下和浮游状态下产生水溶性胞外多糖和水不溶性胞外多糖量的差异,分析在生物膜不同形成阶段多糖的作用。
方法:1.采用微生物培养技术将远缘链球菌在玻璃片上形成单菌种生物膜,用荧光染料BOBO-3、Fluorescein、BODIPY和Calcofluor进行荧光染色,激光共聚焦扫描显微镜分别观察1、3、4、6、9、12、16和24小时的生物膜结构和其中胞外多糖的分布。
2.将远缘链球菌分别进行静置培养和摇动培养,以得到黏附状态和浮游状态下的远缘链球菌,蒽酮法测量两种状态下不同培养时间和蔗糖底物浓度下细菌产生的胞外多糖的差异。
结果:1.远缘链球菌能够在玻璃表面黏附形成致密的生物膜,多糖的黏附和聚集是生物膜初始黏附和发展的前提,在此阶段存在细菌和多糖的消除和重建过程;成熟生物膜的特征是形成大量微菌落和沟壑间隙,临近黏附表面的生物膜基底部位细菌密度较低,而中部则较致密。在生物膜发展和成熟期,胞外多糖分布与菌落中细菌的分布基本一致,提示远缘链球菌依靠其产生的胞外多糖聚集形成了生物膜。
2.生物膜初始黏附状态和发展时期,远缘链球菌产生水溶性胞外多糖和水不溶性胞外多糖的数量与浮游状态的比较未有明确结果:在成熟生物膜情况下,随着培养时间增加,生物膜黏附状态下细菌合成水溶性胞外多糖量无差异,合成水不溶性胞外多糖的量明显增加(P<0.05);随着培养基中糖浓度的增加,生物膜黏附状态下远缘链球菌产生水不溶性胞外多糖的数量明显增加(P<0.05),在各种糖浓度条件下,生物膜中产生的水不溶性胞外多糖量均要多于浮游状态产生的糖量,差异有显著性(P<0.05)。
结论:胞外多糖聚集是远缘链球菌单菌种生物膜发展和成熟的基础,在成熟生物膜中,培养时间和蔗糖底物浓度增加导致细菌合成的水不溶性胞外多糖较浮游状态明显增加;生物膜特殊的生长环镜是造成这种差异的可能原因。