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目的:肝纤维化是慢性或反复肝损伤共同导致的肝脏反应。而药物、病毒、酗酒、高脂高糖以及营养不良等因素均可导致肝纤维化的发生。肝星状细胞(HSCs)是基质成分的主要来源，在肝纤维化的形成过程中起着至关重要的作用，而肝细胞作为各种肝毒性介质作用的主要靶细胞，当受到病毒、酒精的代谢物或胆汁酸等刺激后，会释放大量活性氧(ROS)和炎性介质，加剧肝纤维化的发生。茗葱(Allium victorialis L.AVL)作为一种食物，由于其具有抗炎、抗氧化、抗癌等活性，曾用于传统中药。本实验采用酒精、蛋氨酸胆碱缺乏饮食(MCD)以及硫代乙酰氨(TAA)建立体内肝纤维化模型，通过AML12、HepG2以及HSC细胞建立相应的体外模型，以研究AVL在脂肪蓄积、炎症反应以及肝纤维化中潜在的作用机制。
方法:(1)采用醇提法制备AVL提取物;(2)AVL改善酒精诱导的肝脏脂质蓄积、炎症反应以及纤维化的机制研究。在体内实验中，将C57BL/6小鼠随机分为六组:正常组、ETOH组、ETOH+AVL给药(100 mg/kg、200 mg/kg、300 mg/kg)以及ETOH+水飞蓟素(100 mg/kg)。正常组小鼠每天给予Lieber-DeCarli液体对照饲料喂养，其他组小鼠每天给予含5％(vol/vol)酒精的Lieber-DeCarli(L-D)液体饲料喂养，并灌胃给予AVL(100 mg/kg、200 mg/kg、300 mg/kg)以及水飞蓟素(100 mg/kg)，实验周期为4周。在第四周末，除正常组外，其他组小鼠均给予单次酒精灌胃(5 g/kg)。酒精灌胃6h后，将小鼠在麻醉状态下处死，收集小鼠血清和肝脏存放于-80℃。采用试剂盒对血清中ALT、AST以及肝脏中TG的表达进行检测，此外，我们采用H&E染色、油红染色、Nilered等检测方法来观察肝脏组织病理学变化。采用蛋白印迹法以及Q-PCR法来检测脂肪蓄积、炎症反应以及肝纤维化指标相关蛋白的表达水平。在体外实验中，我们采用酒精诱导AML12、HepG2细胞以模拟体外酒精诱导的脂肪变性，对细胞中核受体、SREBP1、Lipin1和Lipin2进行蛋白免疫印迹分析，测定其表达水平;(3)AVL改善蛋氨酸胆碱缺乏饮食诱导的非酒精性脂肪肝的机制研究。实验采用C57BL/6小鼠，随机分为六组:正常组、MCD组、MCD+AVL给药(100 mg/kg、200mg/kg、300 mg/kg)以及MCD+水飞蓟素(100 mg/kg)。正常组小鼠给予MCS对照饲料喂养，除正常组外，其他各组小鼠均给予MCD饮食喂养，并灌胃给予AVL(100 mg/kg、200 mg/kg、300mg/kg)以及水飞蓟素(100 mg/kg)，4周后，小鼠在麻醉状态下处死，收集血清和肝脏，并存放于-80℃冰箱。除对血清中ALT、AST及肝脏中TG进行检测外，本实验还采用H&E等检测方法观察肝脏组织中脂肪变性情况。采用蛋白印迹法以及Q-PCR法来检测脂肪合成、炎症以及纤维化相关蛋白的表达情况。在体外实验中，采用OA诱导HepG2细胞，模拟体外脂肪蓄积，并给予AVL处理，收集细胞，对细胞中核受体、脂肪合成以及LKB1、AMPK、ACC以及SIRT1等蛋白的表达水平进行蛋白免疫印迹分析;(4)AVL改善硫代乙酰胺诱导肝脏炎症及纤维化的机制研究。将ICR小鼠随机分为六组:正常组、TAA组、TAA+AVL给药(100 mg/kg、200 mg/kg、300 mg/kg)以及TAA+水飞蓟素(100 mg/kg)。除正常组外，其他各组小鼠均通过腹腔注射的方式给予TAA，周期为5周(第一周:100mg/kg，一周三次;第二-四周:200mg/kg，一周两次)，除正常组外，其他组小鼠每天灌胃给予AVL或silymarin。5周后，小鼠在麻醉状态下处死，收集血清和肝脏用于后续实验。先对血清中AST/ALT的水平进行检测，接着通过H&E染色以及天狼猩红染色检测AVL对小鼠肝脏组织病理学变化的影响，再通过蛋白印迹、免疫组化染色等方法对小鼠肝脏中肝纤维化、炎症、STAT3、TLR4等蛋白的表达进行检测。在体外实验中，采用LPS刺激的Raw264.7细胞的上清液活化HSC细胞，通过对α-SMA等纤维化指标、IL-6等炎症因子的表达进行检测，以进一步探究AVL对肝脏炎症以及纤维化的改善作用。
结果:(1)将制备的茖葱提取物存放于4℃;(2)在酒精性脂肪肝模型中，AVL能够降低酒精诱导的血清中ALT/AST以及肝脏中TG的表达，改善酒精诱导的小鼠肝脏组织病理学变化，抑制SREBP1、CYP2E1、Lipin1、Lipin2等脂肪相关蛋白的表达，此外，AVL还能够调控核受体，如PPARs、LXRs以及FXR的表达，减少炎症因子的释放，包括:IL1α、IL1β、caspase1等;激活Sirt1/AMPK/LKB1相关蛋白的表达，抑制α-SMA、CollagenI以及TIMP1的表达。在体外实验中，AVL能够改善酒精诱导的细胞中脂滴的形成，调控SREBP1、Lipin1以及Lipin2的表达，激活FXR的表达，进而减少炎症因子的释放，改善肝纤维化的形成;(3)在非酒精性脂肪肝中，蛋氨酸胆碱缺乏能够导致小鼠肝脏中TG、MDA、血清中AST/ALT表达的升高，而AVL能够抑制这些指标的表达;组织病理学、蛋白印迹以及Q-PCR实验结果显示MCD喂养4周能够导致小鼠肝脏中出现明显的脂肪变性，甚至出现一定程度的肝纤维化，而AVL能够降低SREBP1以及其靶基因、Lipin1/2的表达，改善MCD诱导的肝脏脂肪变性;此外，AVL对于MCD诱导的炎症相关蛋白，如NLRP3、IL18以及IL1β的表达也有一定的抑制作用;AVL可以调控LKB1/AMPK相关蛋白的表达来改善非酒精性脂肪肝;AVL能够调控核受体FXR、LXRs以及PPARs的表达;AVL能够抑制肝纤维化指标的升高，进而抑制MCD诱导的肝纤维化的发生;在体外实验中，AVL能够抑制OA诱导的HepG2细胞中脂滴的形成，这与SREBP1的表达被抑制有关;此外，细胞实验结果发现AVL能够通过调控AMPKα来激活LKB1/ACC/SIRT1等蛋白的表达，激活核受体FXR以及PPARα，抑制SREBP1的表达，进而改善OA诱导的脂肪变性;(4)在硫代乙酰胺诱导的小鼠肝纤维化模型中，AVL能够抑制硫代乙酰胺诱导的小鼠血清中AST以及ALT的表达;组织病理学以及蛋白印迹结果显示，AVL能够改善TAA诱导的肝脏中胶原沉积，抑制α-SMA、CollagenI以及TIMP1等肝纤维化蛋白的表达，抑制TAA诱导的炎症因子的释放;此外，AVL还能够调控STAT3、TLR4等相关蛋白的表达;在体外实验中，蛋白印迹以及Q-PCR实验结果显示，AVL能够改善Raw上清诱导的HSC细胞的活化，抑制细胞中IL6、NLRP3以及IL1R1等相关炎症因子的释放。
结论:(1)AVL能够改善酒精诱导的小鼠酒精性脂肪肝;(2)AVL可以改善蛋氨酸胆碱缺乏诱导的伴有脂肪变性发生的肝脏炎症以及肝纤维化;(3)AVL改善硫代乙酰胺诱导的肝脏炎症以及纤维化。总而言之，AVL对于不同种属中不同因素诱导的肝脏炎症及纤维化均有一定的抑制作用，本研究对开发靶点明确、有效、安全的抗肝纤维化及肝保护药物提供理论基础。
方法:(1)采用醇提法制备AVL提取物;(2)AVL改善酒精诱导的肝脏脂质蓄积、炎症反应以及纤维化的机制研究。在体内实验中，将C57BL/6小鼠随机分为六组:正常组、ETOH组、ETOH+AVL给药(100 mg/kg、200 mg/kg、300 mg/kg)以及ETOH+水飞蓟素(100 mg/kg)。正常组小鼠每天给予Lieber-DeCarli液体对照饲料喂养，其他组小鼠每天给予含5％(vol/vol)酒精的Lieber-DeCarli(L-D)液体饲料喂养，并灌胃给予AVL(100 mg/kg、200 mg/kg、300 mg/kg)以及水飞蓟素(100 mg/kg)，实验周期为4周。在第四周末，除正常组外，其他组小鼠均给予单次酒精灌胃(5 g/kg)。酒精灌胃6h后，将小鼠在麻醉状态下处死，收集小鼠血清和肝脏存放于-80℃。采用试剂盒对血清中ALT、AST以及肝脏中TG的表达进行检测，此外，我们采用H&E染色、油红染色、Nilered等检测方法来观察肝脏组织病理学变化。采用蛋白印迹法以及Q-PCR法来检测脂肪蓄积、炎症反应以及肝纤维化指标相关蛋白的表达水平。在体外实验中，我们采用酒精诱导AML12、HepG2细胞以模拟体外酒精诱导的脂肪变性，对细胞中核受体、SREBP1、Lipin1和Lipin2进行蛋白免疫印迹分析，测定其表达水平;(3)AVL改善蛋氨酸胆碱缺乏饮食诱导的非酒精性脂肪肝的机制研究。实验采用C57BL/6小鼠，随机分为六组:正常组、MCD组、MCD+AVL给药(100 mg/kg、200mg/kg、300 mg/kg)以及MCD+水飞蓟素(100 mg/kg)。正常组小鼠给予MCS对照饲料喂养，除正常组外，其他各组小鼠均给予MCD饮食喂养，并灌胃给予AVL(100 mg/kg、200 mg/kg、300mg/kg)以及水飞蓟素(100 mg/kg)，4周后，小鼠在麻醉状态下处死，收集血清和肝脏，并存放于-80℃冰箱。除对血清中ALT、AST及肝脏中TG进行检测外，本实验还采用H&E等检测方法观察肝脏组织中脂肪变性情况。采用蛋白印迹法以及Q-PCR法来检测脂肪合成、炎症以及纤维化相关蛋白的表达情况。在体外实验中，采用OA诱导HepG2细胞，模拟体外脂肪蓄积，并给予AVL处理，收集细胞，对细胞中核受体、脂肪合成以及LKB1、AMPK、ACC以及SIRT1等蛋白的表达水平进行蛋白免疫印迹分析;(4)AVL改善硫代乙酰胺诱导肝脏炎症及纤维化的机制研究。将ICR小鼠随机分为六组:正常组、TAA组、TAA+AVL给药(100 mg/kg、200 mg/kg、300 mg/kg)以及TAA+水飞蓟素(100 mg/kg)。除正常组外，其他各组小鼠均通过腹腔注射的方式给予TAA，周期为5周(第一周:100mg/kg，一周三次;第二-四周:200mg/kg，一周两次)，除正常组外，其他组小鼠每天灌胃给予AVL或silymarin。5周后，小鼠在麻醉状态下处死，收集血清和肝脏用于后续实验。先对血清中AST/ALT的水平进行检测，接着通过H&E染色以及天狼猩红染色检测AVL对小鼠肝脏组织病理学变化的影响，再通过蛋白印迹、免疫组化染色等方法对小鼠肝脏中肝纤维化、炎症、STAT3、TLR4等蛋白的表达进行检测。在体外实验中，采用LPS刺激的Raw264.7细胞的上清液活化HSC细胞，通过对α-SMA等纤维化指标、IL-6等炎症因子的表达进行检测，以进一步探究AVL对肝脏炎症以及纤维化的改善作用。
结果:(1)将制备的茖葱提取物存放于4℃;(2)在酒精性脂肪肝模型中，AVL能够降低酒精诱导的血清中ALT/AST以及肝脏中TG的表达，改善酒精诱导的小鼠肝脏组织病理学变化，抑制SREBP1、CYP2E1、Lipin1、Lipin2等脂肪相关蛋白的表达，此外，AVL还能够调控核受体，如PPARs、LXRs以及FXR的表达，减少炎症因子的释放，包括:IL1α、IL1β、caspase1等;激活Sirt1/AMPK/LKB1相关蛋白的表达，抑制α-SMA、CollagenI以及TIMP1的表达。在体外实验中，AVL能够改善酒精诱导的细胞中脂滴的形成，调控SREBP1、Lipin1以及Lipin2的表达，激活FXR的表达，进而减少炎症因子的释放，改善肝纤维化的形成;(3)在非酒精性脂肪肝中，蛋氨酸胆碱缺乏能够导致小鼠肝脏中TG、MDA、血清中AST/ALT表达的升高，而AVL能够抑制这些指标的表达;组织病理学、蛋白印迹以及Q-PCR实验结果显示MCD喂养4周能够导致小鼠肝脏中出现明显的脂肪变性，甚至出现一定程度的肝纤维化，而AVL能够降低SREBP1以及其靶基因、Lipin1/2的表达，改善MCD诱导的肝脏脂肪变性;此外，AVL对于MCD诱导的炎症相关蛋白，如NLRP3、IL18以及IL1β的表达也有一定的抑制作用;AVL可以调控LKB1/AMPK相关蛋白的表达来改善非酒精性脂肪肝;AVL能够调控核受体FXR、LXRs以及PPARs的表达;AVL能够抑制肝纤维化指标的升高，进而抑制MCD诱导的肝纤维化的发生;在体外实验中，AVL能够抑制OA诱导的HepG2细胞中脂滴的形成，这与SREBP1的表达被抑制有关;此外，细胞实验结果发现AVL能够通过调控AMPKα来激活LKB1/ACC/SIRT1等蛋白的表达，激活核受体FXR以及PPARα，抑制SREBP1的表达，进而改善OA诱导的脂肪变性;(4)在硫代乙酰胺诱导的小鼠肝纤维化模型中，AVL能够抑制硫代乙酰胺诱导的小鼠血清中AST以及ALT的表达;组织病理学以及蛋白印迹结果显示，AVL能够改善TAA诱导的肝脏中胶原沉积，抑制α-SMA、CollagenI以及TIMP1等肝纤维化蛋白的表达，抑制TAA诱导的炎症因子的释放;此外，AVL还能够调控STAT3、TLR4等相关蛋白的表达;在体外实验中，蛋白印迹以及Q-PCR实验结果显示，AVL能够改善Raw上清诱导的HSC细胞的活化，抑制细胞中IL6、NLRP3以及IL1R1等相关炎症因子的释放。
结论:(1)AVL能够改善酒精诱导的小鼠酒精性脂肪肝;(2)AVL可以改善蛋氨酸胆碱缺乏诱导的伴有脂肪变性发生的肝脏炎症以及肝纤维化;(3)AVL改善硫代乙酰胺诱导的肝脏炎症以及纤维化。总而言之，AVL对于不同种属中不同因素诱导的肝脏炎症及纤维化均有一定的抑制作用，本研究对开发靶点明确、有效、安全的抗肝纤维化及肝保护药物提供理论基础。