本文内容分为两部分进行了论述：　　第一部分输卵管间充质干细胞分离培养与鉴定　　目的：　　输卵管组织为临床妇产科手术后常见废弃组织，本实验旨在通过细胞形态，细胞表面标志物分析及体外诱导分化实验证明输卵管组织中存在间充质干细胞(MSCs)，并通过体外诱导分化实验证明输卵管干细胞的多向分化潜能。　　方法：　　1、收取2013年6月至9月就诊于北京海军总医院手术治疗的6例患者的输卵管组织，6例患者因子宫肌瘤、子宫内膜癌、子宫颈癌及卵巢癌等疾病行输卵管组织切除术。　　2、利用体外胰酶消化法将输卵管组织进行消化，然后行细胞培养及细胞传代。　　3、将P3代细胞行流式细胞学鉴定，鉴定所用抗体为:CD13-FITC，CD29-APC，CD44-APC，CD90-FITC，CD14-APC，CD19-APC，CD34-PE,CD45-FITC，CD73-PE，CD105-PercP，CD166-PE，HLA-DR-APC,HLA-ABC-FITC。　　4、取P3代输卵管细胞在体外通过诱导分化培养基而向骨、脂肪及软骨方向进行诱导分化，并将诱导分化后的细胞行RT-PCR鉴定。成脂分化引物:PPAR-γ2和AP2;成骨分化引物:Osteocalcin、Osteopontin和ALP;成软骨分化引物:Sox-9和COMP。　　结果：　　1、本实验中输卵管中培养出来的细胞符合2006年美国国际细胞治疗协会所提出的关于间充质干细胞的鉴定标准，所以本实验证明了输卵管组织分离培养出来的细胞为间充质干细胞。　　2、输卵管间充质干细胞在体外具有向骨、脂肪及软骨多向分化的潜能。　　结论：　　输卵管组织是妇产科手术后常见的临床废弃组织，根据2006年美国国际细胞治疗协会提出的间充质干细胞的鉴定标准:1.细胞为贴壁细胞。2.流式细胞结果必须≥95％的MSCs表达CD105、CD90和CD73，同时必须满足≤2％的MSCs表达CD34、CD45、CD14、CD11b、CD79α、CD19和HLA-Ⅱ。3.细胞在体外具有向骨、脂肪及软骨分化的能力。本实验中输卵管细胞在培养48小时后贴壁，经流式细胞分析结果显示:输卵管细胞均阳性表达CD73、CD105和CD90，同时输卵管细胞在体外具备向成骨、软骨及脂肪分化能力。所以，输卵管组织中存在间充质干细胞，也间接说明了输卵管组织是间充质干细胞的又一新来源，体外诱导分化实验也证明了输卵管间充质干细胞具有向骨、脂肪与软骨分化的潜能，可以为输卵管间充质干细胞治疗相关方面的疾病提供依据。　　第二部分输卵管与输卵管内膜干细胞的比较研究　　目的：　　体外分离培养及鉴定输卵管内膜间充质干细胞。并从细胞形态、表型、增殖分化及体外因子分泌等方面将输卵管与输卵管内膜间充质干细胞进行比较研究，并从生物学特性和治疗潜能角度来评估他们对于组织损伤修复的潜能。　　方法：　　1、取同一患者的输卵管组织（左侧）和输卵管内膜组织（右侧），患者年龄为35-55岁之间，6例患者因子宫肌瘤、子宫内膜癌、子宫颈癌及卵巢癌等疾病行输卵管组织切除术。　　2、将输卵管与输卵管内膜组织在体外用胰酶+胶原酶Ⅰ消化法将组织消化成细胞，然后行细胞培养及细胞传代。　　3、取P3代输卵管与输卵管内膜细胞进行流式细胞学分析来鉴定细胞表面分子标志物，所用抗体:CD13-FITC，CD29-APC，CD44-PE，CD90-FITC，CD14-APC，CD19-APC，CD34-PE，CD45-FITC，CD73-PE，CD105-PercP,CD166-PE，HLA-DR-APC，HLA-ABC-FITC。　　4、用克隆形成率与CCK-8两种方法来比较P3代输卵管与输卵管内膜细胞的增殖能力。　　5、体外诱导分化实验:将P3代输卵管与输卵管内膜细胞在体外经诱导分化培养基培养后向骨、脂肪及软骨方向诱导分化。　　6、将输卵管与输卵管内膜细胞诱导分化为骨、脂肪及软骨后，通过RT-PCR方法比较两者诱导分化后与骨、脂肪及软骨相关基因表达水平，从而比较两者的诱导分化潜能。　　7、采用ELISA方法来检测P3代输卵管与输卵管内膜细胞生长及免疫因子分泌水平，并将两者的因子分泌水平进行比较。　　8、统计学处理:本实验所有检测样品均为一式三份。计量资料用平均数±标准差表示，两独立样本间比较采用两独立样本t检验，实时RT-PCR数据结果采用2008版本的REST(Relative Expression Software Tool2008)进行相对定量基因表达分析，按α=0.05检验水平，P＜0.05为差异有统计学意义。　　结果：　　1、根据2006年美国国际细胞治疗协会提出的关于间充质干细胞鉴定相关标准，本实验从输卵管内膜获取细胞符合此项鉴定标准。　　2、流式细胞学结果:输卵管与输卵管内膜间充质干细胞均阳性表达间充质干细胞相关表面分子标志物(CD90，CD73，CD105)以及细胞粘附分子(CD166，HLA-ABC)，均阴性表达造血干细胞血表面标志物(CD34，CD45，CD14，HLA-DR，CD19)。与输卵管内膜间充质干细胞相比较，输卵管间充质干细CD44及CD13的表达显著增强。　　3、克隆形成率:与输卵管间充质干细胞相比较，输卵管内膜间充质干细胞形成克隆团数量较多，差异具有统计学意义。　　4、根据CCK-8结果绘制出的生长曲线图提示:1、P3代输卵管内膜间充质干细胞对数生长期倍增时间短于输卵管间充质干细胞差异具有统计学意义。　　2、输卵管内膜间充质干细胞增殖能力强于输卵管间充质干细胞。　　5、体外诱导分化实验结果提示:P3代输卵管与输卵管内膜间充质干细胞都具有在体外向骨、脂肪及软骨分化的潜能。　　6、RT-PCR结果提示:与输卵管内膜间充质干细胞相比较，输卵管间充质干细胞经成骨诱导分化后，Osteocalcin、Osteoponlin及ALP三种骨相关基因表达水平均高于输卵管内膜间充质干细胞。输卵管与输卵管内膜间充质干细胞经成脂及成软骨诱导分化后，两者脂肪及软骨相关基因表达水平无明显差别。　　7、体外因子分泌结果提示:输卵管与输卵管内膜间充质干细胞在体外均分泌一定量的生长因子及免疫因子，生长因子包括:bFGF、EGF、GM-CSF、HGF及VEGF。免疫因子包括:IL-4、IL-6、TNF-α、TNF-β及IFN-γ。生长因子检测结果:输卵管内膜间充质干细胞分泌的bFGF、EGF及GM-CSF水平高于输卵管间充质干细胞，但输卵管间充质干细胞分泌HGF与VEGF水平较高。免疫因子检测结果:输卵管内膜干细胞相对分泌较高水平免疫因子IL-4，TNF-α和TNF-β。但是输卵管间充质干细胞相对分泌较高水平的IFN-γ。IL-6分泌水平在两者之间并没有明显差距。IL-2与IL-10均因浓度太低未能检测。　　结论：　　1、本实验证实输卵管内膜中存在间充质干细胞。我们将其命名为输卵管内膜间充质干细胞。　　2、与输卵管间充质干细胞相比较，输卵管内膜间充质干细胞表现出较强的增殖能力及较短的倍增时间，增殖能力是评估干细胞治疗潜能的重要指标，提示输卵管内膜间充质干细胞具有更大的治疗前景。　　3、经体外诱导及RT-PCR实验结果提示:输卵管间充质干细胞表现出极强的成骨能力，与输卵管内膜间充质干细胞相比较，输卵管间充质干细胞在治疗骨相关疾病可能表现出较强优势。　　4、输卵管内膜干细胞分泌较高水平的bFGF，EGF及GM-CSF，bFGF和EGF均参与上皮损伤后修复过程，在上皮修复过程中起着至关重要的作用。并且bFGF和EGF均可以加速伤口愈合减少疤痕形成。　　5、与输卵管间充质干细胞相比较，输卵管内膜干细胞分泌更较高水平的抗炎症因子IL-4、GM-CSF及较低水平的促炎因子IFN-γ，说明输卵管内膜干细胞具有抗炎症反应作用，因此在慢性炎症损伤中，输卵管内膜间充质干细胞可以加速愈合速度，快速度过慢性炎症期。　　6、与输卵管间充质干细胞相比较，输卵管内膜间充质干细胞表现出较强的增殖能力及因子分泌水平。经体外基础实验研究可以认为对于组织损伤修复，与输卵管间充质干细胞相比较，输卵管内膜间充质干细胞更加具有修复潜能。　　7、内膜组织覆盖于人类的腔道系统，内膜组织具有强大的再生能力，并且具有易获取性。本实验从增殖潜能及修复潜能方面将输卵管内膜间充质干细胞与输卵管间充质干细胞比较后发现，输卵管内膜间充质干细胞具有潜在的增殖与组织修复能力，因此我们提出了新观点:内膜组织间充质干细胞在未来应用方面更加具有优势。