论文部分内容阅读
小麦是世界上栽培面积最广且最重要的粮食作物之一,小麦产量的丰歉直接关系着世界粮食的供给。但小麦每年因病害减产约10 %～50 % ,尤其是白粉病对小麦的危害更为严重。小麦白粉病(Blumeria graminis f. sp. tritici)是目前危害我国小麦生产的主要病害之一。白粉病原菌的生理小种多,毒性变异速度快,很容易造成品种抗病性的丧失。因此,发掘、利用抗病品种,研究抗病机制是当前需要亟待解决的问题。本研究以小麦-黑麦抗白粉病衍生系为试验材料,对其白粉病抗性的遗传特性进行了分析,并通过抑制性消减杂交cDNA文库的构建和测序分析,对其抗白粉病相关基因的差异表达进行了研究,对部分基因进行了克隆。结果如下:1以小麦-黑麦衍生系N9436-1和N9436-2为材料,采用农艺性状调查、白粉病抗性鉴定、细胞学方法、基因组原位杂交、生化标记及分子标记等方法对其进行了遗传分析。结果表明,N9436-1为小麦-黑麦1R二体异附加系,对白粉病高抗至免疫且多小穗;N9436-2为小麦-黑麦6R二体异附加系,紫杆且高抗白粉病。2以抗白粉病小麦种质N9436-1为材料,利用抑制性消减杂交技术构建了白粉菌接种72h的正反交文库。正反交文库分别挑取了550个克隆进行菌液PCR鉴定,接着随机挑取鉴定为阳性的克隆进行测序。3正交文库随机挑取140个阳性克隆进行测序,去除冗余重复序列及小于100bp的序列外,递交GenBank数据库。GenBank收录号为EX567357—EX567450,dbEST-Id为50073321—50073414。对所获94个EST在NCBI的非冗余蛋白数据库进行BlastX比对,结果表明,49个EST与已知功能蛋白同源性较高,主要涉及初级代谢(2%)、能量代谢(24%)、细胞结构(2%)、转录(2%)、蛋白质合成加工与储藏(16%)、转运(4%)、信号转导(4%)及抗病防御(30%),此外,未知功能的EST占16%。经文库比对,得到白粉病抗病相关蛋白22个,其中与抗病信号转导相关蛋白6个,过敏性坏死反应(HR)体系表达蛋白2个,系统获得性抗性(SAR)体系病程相关蛋白4个,系统获得性抗性(SAR)体系诱导防卫蛋白10个。4反交文库中随机挑取120个阳性克隆进行测序,去除冗余序列和重复序列以及小于100 bp的序列后,将获得的的59个非重复序列递交GenBank。GenBank收录号为EX567298—EX567356,dbEST-Id为50073262—50073320。对所获59个EST在NCBI的非冗余蛋白数据库进行BlastX比对,结果表明,23个EST与已知功能蛋白同源性较高,主要涉及初级代谢(9%)、能量代谢(44%)、转录(4%)、转运(9%)、信号转导(4%)及抗病防御(26%),此外,未知功能的EST占4%。经文库比对,得到白粉病抗病相关蛋白7个,其中与抗病信号转导相关蛋白1个,系统获得性抗性(SAR)体系病程相关蛋白5个,系统获得性抗性(SAR)体系诱导防卫蛋白1个。5采用半定量RT-PCR方法,对文库中的部分EST进行验证。验证结果表明病程相关蛋白(Z25-1)、谷胱甘肽硫转移酶(Z440-1)、过氧化物酶(Z208)、细胞色素P450(Z219-1)、胁迫响应性蛋白(F76)、磷酸核酮糖激酶(F105)、乙二醛酶(F110-1)、羟基丙酮酸还原酶(F167)都属于白粉菌诱导型相关基因,参与抗白粉病反应中。其中病程相关蛋白、谷胱甘肽硫转移酶、过氧化物酶和磷酸核酮糖激酶属于白粉菌诱导后的上调基因,而细胞色素P450和乙二醛酶属于下调基因。6应用电子克隆技术对文库中5个EST进行延伸,然后根据序列设计引物进行RT-PCR验证。目的片段回收后测序结果分析表明,谷胱甘肽硫转移酶序列长度为875bp,有编码229个氨基酸的开放阅读框。将得到的氨基酸序列首先通过blastp分析蛋白质结构域,结果表明含有一个N端和C端谷胱甘肽硫转移酶结构域。接着利用InterProScan进行预测,发现该序列具有谷胱甘肽硫转移酶N端和C端结构域以及硫氧还蛋白折叠区结构域和谷胱甘肽硫转移酶超家族结构域。以上结果表明克隆得到一个编码谷胱甘肽硫转移酶的基因片段。利用SubLoc v1.0将该基因片段定位在细胞核上。Compute pI/Mw tool软件推测该蛋白的等电点为4.97,分子量为71910.41Da。