【摘 要】
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背景:血栓性疾病是严重危害人类身体健康的一组循环系统疾病,是中老年人群的常见病、多发病,具有高致死率和致残率,已成为当今社会威胁人类健康和生命的重要疾病[1]。目前血栓性疾病的治疗方式中溶栓治疗是最为普遍和有效的。尿激酶由于疗效好、原料丰富、价格便宜,是临床上最常用的溶栓药。但由于尿激酶没有血栓靶向性,使用高浓度的尿激酶溶栓容易导致全身出血并发症。已有大量研究表明,RGD序列能与活化的血小板膜糖蛋
【基金项目】
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项目名称:超声预警慢性肺动脉高压肺小动脉原位血栓及携RGDS载尿激酶微泡靶向溶栓的实验研究,项目合同编号:81760314,项目来源:国家自然科学基金,项目起止时间:2018.01-2021.12
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背景:血栓性疾病是严重危害人类身体健康的一组循环系统疾病,是中老年人群的常见病、多发病,具有高致死率和致残率,已成为当今社会威胁人类健康和生命的重要疾病[1]。目前血栓性疾病的治疗方式中溶栓治疗是最为普遍和有效的。尿激酶由于疗效好、原料丰富、价格便宜,是临床上最常用的溶栓药。但由于尿激酶没有血栓靶向性,使用高浓度的尿激酶溶栓容易导致全身出血并发症。已有大量研究表明,RGD序列能与活化的血小板膜糖蛋白IIb/IIIa受体特异性地结合,具有抗血小板聚集和血栓靶向作用,是血栓的靶点之一。脂质体是一种药物载体,具有被动靶向性和缓释性,用聚乙二醇（PEG）修饰脂质体表面而制备出的长循环脂质体能够延长在体循环的时间,使得药物在病灶部位的聚集量提高,因此,以PEG化的脂质体作为载体,同时表面修饰RGD序列作为血栓的导向分子,将尿激酶包封于脂质体内部,制备成负载尿激酶cRGD修饰脂质体,提高尿激酶的特异性和血栓靶向性,使尿激酶选择性地作用于血栓部位,减少出血副作用和其他不良反应。目的:采用薄膜分散法制备负载尿激酶cRGD修饰脂质体并检测其理化特性,为后续慢性肺动脉高压动物模型在体溶栓实验做准备。方法:采用薄膜分散法制备空白脂质体和负载尿激酶cRGD修饰脂质体。取少量制备好的脂质体用光学显微镜观察其形态及大小,负载尿激酶cRGD修饰脂质体用透射电镜观察其形态和大小,用纳米粒度仪来检测脂质体的粒径。观察一定时间内负载尿激酶cRGD修饰脂质体在含50%胎牛血清的PBS缓冲液中的粒径变化,用以研究其在血清中的稳定性。用制备好的负载尿激酶cRGD修饰脂质体对红细胞进行体外溶血实验,研究不同浓度的脂质体对红细胞是否有溶血反应。用人脐静脉内皮细胞研究不同浓度的负载尿激酶cRGD修饰的脂质体对细胞是否有毒性作用。用Bradford蛋白测定试剂盒检测负载尿激酶cRGD修饰脂质体对尿激酶的包封率和载药量。在体外模拟负载尿激酶cRGD修饰脂质体的释放实验,计算脂质体中尿激酶的累积释放率。在循环条件下,用负载尿激酶cRGD修饰脂质体溶解血栓,观察脂质体的体外溶栓效果。结果:1、空白脂质体粒径约为143.9nm,负载尿激酶cRGD修饰脂质体粒径约为176.8nm,脂质体在光学显微镜下显示不清。2、72小时内负载尿激酶cRGD修饰脂质体在含50%胎牛血清的PBS缓冲液中粒径变化不大,说明其在血清中能保持稳定。3、负载尿激酶cRGD修饰脂质体的溶血率小于5%,显示脂质体对红细胞无溶血效应。4、细胞毒性实验各浓度脂质体中细胞存活率均大于90%,提示负载尿激酶cRGD修饰脂质体无明显细胞毒性作用。5、负载尿激酶cRGD修饰脂质体对尿激酶的包封率约为58.83%,载药量约为40.64%。6、负载尿激酶cRGD修饰脂质体的体外模拟释放实验显示在1h时,尿激酶的累积释放率为18.57%,到第8h时,累积释放率为56.19%并到达平台期,表明负载尿激酶cRGD修饰脂质体在8小时内可释放出大部分包封的尿激酶。7、体外溶栓实验结果显示负载尿激酶cRGD修饰脂质体的溶栓率为83.14%。结论:采用薄膜分散法成功制备出了负载尿激酶cRGD修饰脂质体,其为纳米制剂,在血清中稳定,在体外对红细胞无溶血效应,无细胞毒性作用,在体外8小时内可释放大部分包封的尿激酶,可以在体外高效溶栓。
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