【摘 要】
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丁醇是一种重要的工业化学品和理想的生物燃料,由产溶剂梭菌,主要是丙酮丁醇梭菌,通过丙酮-丁醇-乙醇(ABE)发酵生产。丙酮丁醇梭菌代谢通常包括两个典型阶段:产酸期和产溶剂期。在产酸期,有机酸积累造成pH值降低,抑制细胞生长,细胞进行酸重吸收合成丁醇缓解酸胁迫,或者形成芽孢维持细胞生存。芽孢形成与丁醇代谢同时启动并最终抑制丁醇代谢,不利于丁醇生产。全局转录调控因子Spo0A磷酸化修饰后参与调控细胞生
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丁醇是一种重要的工业化学品和理想的生物燃料,由产溶剂梭菌,主要是丙酮丁醇梭菌,通过丙酮-丁醇-乙醇(ABE)发酵生产。丙酮丁醇梭菌代谢通常包括两个典型阶段:产酸期和产溶剂期。在产酸期,有机酸积累造成pH值降低,抑制细胞生长,细胞进行酸重吸收合成丁醇缓解酸胁迫,或者形成芽孢维持细胞生存。芽孢形成与丁醇代谢同时启动并最终抑制丁醇代谢,不利于丁醇生产。全局转录调控因子Spo0A磷酸化修饰后参与调控细胞生长、丁醇代谢和芽孢形成等生理过程。5个组氨酸激酶Cac3319、Cac0323、Cac0903、Cac2730和Cac0437参与Spo0A磷酸化修饰。通过改造组氨酸激酶调控Spo0A磷酸化水平,从而决定细胞是进行丁醇代谢,或形成芽孢来保证细胞生存。首先,考察出发菌株丙酮丁醇梭菌ATCC 55025的遗传背景、芽孢发育和发酵性能。通过基因组比对发现ATCC 55025和模式菌株ATCC 824基因组序列具有高度同源性和同线性。ATCC 55025进入芽孢发育周期第Ⅲ阶段形成前孢,不能合成成熟芽孢,细胞整体形态变化、产物代谢和细胞自溶现象与ATCC 824相似。两种菌株具有相似的遗传背景和生理代谢特点,但ATCC 55025形成前孢以及连续合成丁醇的性质,更适合作为出发菌株研究组氨酸激酶对芽孢发育进程和菌株稳定性的影响。其次,构建不同激酶表达水平的菌株研究组氨酸激酶对胞内代谢的调控作用。除cac2730,改变其他4个组氨酸激酶表达量对有机酸和丁醇代谢产生不同调控作用,其中cac3319和cac0437作用最为显著。相对于ATCC 55025(丁醇11.0 g/L,有机酸7.0 g/L),cac3319敲除菌丁醇产量提高49.1%,达到16.4 g/L,有机酸降低18.6%,为5.7 g/L,而过表达菌株丁醇产量降低44.5%,为6.1 g/L,有机酸总产量提高到12.8 g/L。改变cac0437表达量的菌株丁醇产量降低(1.9-6.5 g/L)和有机酸产量提高(11.4-14.9 g/L),说明改变cac0437表达量抑制有机酸重吸收。此外,cac3319和cac0323同时敲除后,丁醇产量进一步提高至18.2 g/L。再次,考察代谢显著变化的cac3319敲除菌和过表达菌,以及cac043敲除菌形态变化和芽孢发育情况。敲除cac3319后细胞在整个发酵周期维持高活性杆状结构,没有淀粉粒和前孢形成,发酵末期未观察到细胞自溶现象,表明细胞未进入芽孢发育周期。过表达cac3319促进了淀粉粒、芽孢皮层和芽孢外被合成,发酵末期形成成熟芽孢。敲除cac0437后细胞一端出现暗黑区域类似于芽孢头,未形成淀粉粒和隔膜,可能是芽孢开始形成但没有继续发育成前孢。通过组氨酸激酶改造完全阻断芽孢形成,使细胞在长时间培养中保持稳定,提高了菌株稳定性。在高密度发酵中激酶改造菌株(cac3319/cac0323双敲除菌)丁醇浓度达20.6 g/L,丁醇得率和生产强度分别达到0.23 g/g和0.61 g/L/h。在重复批次发酵中,丁醇平均浓度和生产强度分别达到20.1 g/L和0.46 g/L/h,与出发菌株相比分别提高55.8%和117.4%。因此,基于组氨酸激酶改造增强细胞稳定性,使工程菌株在长时间发酵中持续合成丁醇,保证了丁醇生产过程稳定性。最后,RNA测序分析组氨酸激酶对芽孢形成和丁醇代谢相关基因的调控并指导后续代谢工程改造工作。敲除cac3319,细胞分裂、芽孢形成和细胞自溶相关基因均显著下调,参与有机酸重吸收和丁醇合成的sol操纵子在产溶剂期表达上调4倍左右,是丁醇产量提高的直接原因。考虑到丙酮和氢气合成基因adc和hydA均显著下调,敲除两个基因以降低副产物合成并提高丁醇产量。敲除adc基因,丙酮降低到0.1 g/L,丁醇比例从63.0%提高至87.6%。敲除hydA后氢气和丙酮产量分别降低31.2%和31.9%,并选择性促进丁醇生产。RNA测序分析表明敲除cac3319弱化了 adhE2负责的丁醇合成途径,在cac3319/cac0323双敲除菌中过表达adhE2,丁醇产量进一步提高至19.7 g/L。本论文基于改造组氨酸激酶调控丙酮丁醇梭菌中的芽孢发育和丁醇代谢,增强细胞稳定性和丁醇代谢,提高发酵过程稳定性,从而实现高效节能的丁醇生产。
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