论文部分内容阅读
目的：观察通络益肾方及其拆方滋阴温阳方、解毒通络方含药血清对不同时间点高糖培养的足细胞线粒体自噬的影响，从线粒体自噬稳态失衡-凋亡角度探讨通络益肾方及其拆方解毒通络方、滋阴温阳方治疗DN的可能机制。
方法：足细胞按正常条件培养至一定密度，随机分为：正常组(NG)、高糖组(HG)、通络益肾方组(TLYS)、解毒通络方组(JDTL)、滋阴温阳方组(ZYWY)、甘露醇高渗组(MG)。按各组培养条件分别培养24h、48h、72h，采用透射电镜观察足细胞线粒体超微结构及自噬体，荧光探针MitoSoxRed检测线粒体内ROS生成、RT-PCR检测Txnip、Atg5、Beclin-1、Bax、Bcl-2的mRNA表达，WesternBlot检测Txnip、Atg5、Beclin-1、Bax、Bcl-2蛋白表达。
结果：
1、电镜观察足细胞线粒体及自噬体结果：
与同时间点NG组相比，HG组足细胞受损严重，线粒体均遭到不同程度的破坏。线粒体可见不规整肿胀，内部大量空泡形成并融合，线粒体嵴破坏模糊不清。
与同时间点HG组相比，TLYS组、JDTL组、ZYWY组线粒体损伤减轻，肿胀减轻，空泡减少。线粒体内部均见不同程度的自噬体形成。24h时TLYS组、JDTL组、ZYWY组线粒体自噬体数量较少，呈现双层膜结构。48h时TLYS组、JDTL组、ZYWY组自噬体数量较24h时数量增加，表现为独立双层膜结构，自噬体内部可见包裹的受损线粒体。72h时TLYS组、JDTL组、ZYWY组自噬体数量较24h时数量增加，但与48h时相比数量下降。TLYS组、JDTL组、ZYWY组足细胞线粒体自噬体在24h时开始产生，48h时产生最多，72h时呈下降趋势。
2、MitoSoxRed检测线粒体内ROS生成：
与同时间点NG组相比，HG组mtROS表达量在24h、48h、72h各时间点均显著升高(P＜0.01)，差异有统计学意义。
与同时间点HG组相比，TLYS组、JDTL组mtROS表达在24h、48h、72h各时间点均显著降低(P＜0.01)，差异有统计学意义。ZYWY组mtROS表达在24h时降低(P＜0.05)，在48h时显著降低(P＜0.01)，差异有统计学意义；在72h时降低不明显(P＞0.05)，差异无统计学意义。
与同时间点TLYS组相比，JDTL组mtROS表达在24h、48h、72h时间点稍有升高但无统计学意义(P＞0.05)；ZYWY组mtROS表达在24h、48h、72h时间点显著升高(P＜0.01)，差异有统计学意义。
与同时间点JDTL组相比，ZYWY组mtROS表达在24h时升高(P＜0.05)，在48h、72h时显著升高(P＜0.01)，差异有统计学意义。通络益肾方及其拆方可降低高糖诱导足细胞线粒体活性氧含量，其中全方效果最好，两拆方中JDTL方比ZYWY方效果略好。
3、RT-PCR检测足细胞Txnip、Atg5、Beclin-1、Bax、Bcl-2mRNA表达：
与同时间点NG相比，HG足细胞TxnipmRNA、BaxmRNA表达升高，Atg5mRNA、Beclin-1mRNA、Bcl-2mRNA表达降低(P＜0.05，P＜0.01)，差异具有统计学意义。
与同时间点HG组相比，TLYS、ZYWY、JDTL组足细胞TxnipmRNA、BaxmRNA表达降低，Atg5mRNA、Beclin-1mRNA、Bcl-2mRNA表达升高(P＜0.05，P＜0.01)，差异具有统计学意义。ZYWY方在降低Txnip、升高Atg5、Beclin-1自噬相关基因mRNA表达方面较JDTL方优。JDTL方在降低Bax升高Bcl-2凋亡相关基因mRNA表达方面较ZYWY方优。
4、WesternBlot检测足细胞Txnip、Atg5、Beclin-1、Bax、Bcl-2蛋白表达：
与同时间点NG相比，HG足细胞Txnip、Bax蛋白表达升高，Atg5、Beclin-1、Bcl-2蛋白表达降低(P＜0.05，P＜0.01)，差异具有统计学意义。
与同时间点HG组相比，TLYS、ZYWY、JDTL组足细胞Txnip、Bax蛋白表达降低，Atg5、Beclin-1、Bcl-2蛋白表达升高，差异具有统计学意义(P＜0.05，P＜0.01)。ZYWY方在降低Txnip、升高Atg5、Beclin-1自噬相关蛋白表达方面较JDTL方优。JDTL方在降低Bax，升高Bcl-2凋亡蛋白表达方面较ZYWY方优。
结论：
1、高糖刺激可降低足细胞自噬水平，增加足细胞线粒体活性氧表达，促进足细胞凋亡。通络益肾方可提高足细胞线粒体自噬水平，抑制足细胞线粒体活性氧的产生，抑制足细胞凋亡，其中全方组效果最佳；抑制mtROS生成方面，解毒通络方优于滋阴温阳方。
2、通络益肾方及其拆方可上调Atg5、Beclin-1、Bcl-2mRNA及蛋白的表达，下调Txnip、BaxmRNA及蛋白的表达，而提高足细胞线粒体自噬水平，降低足细胞凋亡率。其中全方效果最佳，在降低Txnip，提高Atg5、Beclin-1等线粒体自噬相关mRNA及蛋白表达方面滋阴温阳方较解毒通络方优；在降低Bax提高Bcl-2等凋亡相关mRNA及蛋白表达方面解毒通络方较滋阴温阳方优。
方法：足细胞按正常条件培养至一定密度，随机分为：正常组(NG)、高糖组(HG)、通络益肾方组(TLYS)、解毒通络方组(JDTL)、滋阴温阳方组(ZYWY)、甘露醇高渗组(MG)。按各组培养条件分别培养24h、48h、72h，采用透射电镜观察足细胞线粒体超微结构及自噬体，荧光探针MitoSoxRed检测线粒体内ROS生成、RT-PCR检测Txnip、Atg5、Beclin-1、Bax、Bcl-2的mRNA表达，WesternBlot检测Txnip、Atg5、Beclin-1、Bax、Bcl-2蛋白表达。
结果：
1、电镜观察足细胞线粒体及自噬体结果：
与同时间点NG组相比，HG组足细胞受损严重，线粒体均遭到不同程度的破坏。线粒体可见不规整肿胀，内部大量空泡形成并融合，线粒体嵴破坏模糊不清。
与同时间点HG组相比，TLYS组、JDTL组、ZYWY组线粒体损伤减轻，肿胀减轻，空泡减少。线粒体内部均见不同程度的自噬体形成。24h时TLYS组、JDTL组、ZYWY组线粒体自噬体数量较少，呈现双层膜结构。48h时TLYS组、JDTL组、ZYWY组自噬体数量较24h时数量增加，表现为独立双层膜结构，自噬体内部可见包裹的受损线粒体。72h时TLYS组、JDTL组、ZYWY组自噬体数量较24h时数量增加，但与48h时相比数量下降。TLYS组、JDTL组、ZYWY组足细胞线粒体自噬体在24h时开始产生，48h时产生最多，72h时呈下降趋势。
2、MitoSoxRed检测线粒体内ROS生成：
与同时间点NG组相比，HG组mtROS表达量在24h、48h、72h各时间点均显著升高(P＜0.01)，差异有统计学意义。
与同时间点HG组相比，TLYS组、JDTL组mtROS表达在24h、48h、72h各时间点均显著降低(P＜0.01)，差异有统计学意义。ZYWY组mtROS表达在24h时降低(P＜0.05)，在48h时显著降低(P＜0.01)，差异有统计学意义；在72h时降低不明显(P＞0.05)，差异无统计学意义。
与同时间点TLYS组相比，JDTL组mtROS表达在24h、48h、72h时间点稍有升高但无统计学意义(P＞0.05)；ZYWY组mtROS表达在24h、48h、72h时间点显著升高(P＜0.01)，差异有统计学意义。
与同时间点JDTL组相比，ZYWY组mtROS表达在24h时升高(P＜0.05)，在48h、72h时显著升高(P＜0.01)，差异有统计学意义。通络益肾方及其拆方可降低高糖诱导足细胞线粒体活性氧含量，其中全方效果最好，两拆方中JDTL方比ZYWY方效果略好。
3、RT-PCR检测足细胞Txnip、Atg5、Beclin-1、Bax、Bcl-2mRNA表达：
与同时间点NG相比，HG足细胞TxnipmRNA、BaxmRNA表达升高，Atg5mRNA、Beclin-1mRNA、Bcl-2mRNA表达降低(P＜0.05，P＜0.01)，差异具有统计学意义。
与同时间点HG组相比，TLYS、ZYWY、JDTL组足细胞TxnipmRNA、BaxmRNA表达降低，Atg5mRNA、Beclin-1mRNA、Bcl-2mRNA表达升高(P＜0.05，P＜0.01)，差异具有统计学意义。ZYWY方在降低Txnip、升高Atg5、Beclin-1自噬相关基因mRNA表达方面较JDTL方优。JDTL方在降低Bax升高Bcl-2凋亡相关基因mRNA表达方面较ZYWY方优。
4、WesternBlot检测足细胞Txnip、Atg5、Beclin-1、Bax、Bcl-2蛋白表达：
与同时间点NG相比，HG足细胞Txnip、Bax蛋白表达升高，Atg5、Beclin-1、Bcl-2蛋白表达降低(P＜0.05，P＜0.01)，差异具有统计学意义。
与同时间点HG组相比，TLYS、ZYWY、JDTL组足细胞Txnip、Bax蛋白表达降低，Atg5、Beclin-1、Bcl-2蛋白表达升高，差异具有统计学意义(P＜0.05，P＜0.01)。ZYWY方在降低Txnip、升高Atg5、Beclin-1自噬相关蛋白表达方面较JDTL方优。JDTL方在降低Bax，升高Bcl-2凋亡蛋白表达方面较ZYWY方优。
结论：
1、高糖刺激可降低足细胞自噬水平，增加足细胞线粒体活性氧表达，促进足细胞凋亡。通络益肾方可提高足细胞线粒体自噬水平，抑制足细胞线粒体活性氧的产生，抑制足细胞凋亡，其中全方组效果最佳；抑制mtROS生成方面，解毒通络方优于滋阴温阳方。
2、通络益肾方及其拆方可上调Atg5、Beclin-1、Bcl-2mRNA及蛋白的表达，下调Txnip、BaxmRNA及蛋白的表达，而提高足细胞线粒体自噬水平，降低足细胞凋亡率。其中全方效果最佳，在降低Txnip，提高Atg5、Beclin-1等线粒体自噬相关mRNA及蛋白表达方面滋阴温阳方较解毒通络方优；在降低Bax提高Bcl-2等凋亡相关mRNA及蛋白表达方面解毒通络方较滋阴温阳方优。