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胶质母细胞瘤（Glioblastoma,GBM）是中枢神经系统恶性程度最高的原发性肿瘤,即使经过标准的手术切除结合术后同步放化疗,仍然有极高的复发率和死亡率,严重损害患者的生命安全。近年来,关于胶质瘤的免疫靶向治疗发展迅速,不断有新的免疫检查点被发现,比如PD-1、CTLA4、TIM3等,多种免疫检查点抑制剂也被不断被发现并应用于肿瘤的免疫治疗。热休克蛋白A6（Heat Shock Protein A6,HSPA6）作为一种高度保守的蛋白质,能够在分子伴侣的辅助下,参与细胞中多种多肽链的结构修饰,以恢复蛋白质的结构以及发挥蛋白质的功能。通过大量文献阅读及前期生物信息学分析发现HSPA6可能是潜在的GBM免疫治疗靶点。通过RNA-seq筛选出PI3K-Akt通路可能是HSPA6调控的潜在下游信号通路。通过蛋白质质谱分析发现EGFR与HSPA6具有较高的潜在结合力。但是,HSPA6促进GBM进展的功能和相关分子机制仍然未知。因此,本项研究旨在明确并揭示HSPA6调控PI3K-Akt信号通路影响GBM进展的功能和具体分子机制。目的:1.生物信息学分析HSPA6在胶质瘤中差异表达并预测其临床研究价值。2.通过细胞功能实验确定HSPA6在GBM细胞中发挥的恶性功能。3.明确HSPA6调控GBM恶性功能的具体分子机制。研究方法1.生物信息学分析方法在我们的研究中,我们首先通过TCGA、CGGA和GEO公共数据库中获取胶质瘤患者相关RNA测序数据以及患者的临床生存数据,通过多方面的差异表达分析确定了HSPA6蛋白质的表达特征,通过进行预后分析绘制Kaplan-Meier生存曲线与总体预后。差异基因分析确定HSPA6高表达及低表达相关基因并进行富集分析,初步预估HSPA6参与的潜在的细胞信号通路。2.临床组织样本确定HSPA6表达特征收集临床胶质瘤组织样本和癌旁组织样本,提取蛋白质检测HSPA6表达水平差异;部分肿瘤组织进行切片后免疫组化染色,明确其在肿瘤中高表达。3.肿瘤细胞培养在本实验中共使用5种GBM细胞系U87、U118、LN229、U251、T98,在高糖培养基（DMEM）+10%胎牛血清（FBS）+1%双抗配置成的完全培养基中进行培养,环境为含5%CO2、100%湿度以及37℃恒温的细胞培养箱中。4.基因编辑在以上GBM细胞系中检测了HSPA6的表达差异,筛选出了表达量最低的U251和表达量最高的U118作为实验细胞系。我们构建了HSPA6过表达（Vector-HSPA6）与敲低（sh-HSPA6）慢病毒质粒,构建稳定的过表达与敲低细胞株。我们将正常及过表达HSPA6的GBM细胞进行RNA-seq,筛选出PI3K-Akt通路可能是HSPA6调控GBM功能的关键通路。5.细胞功能实验我们使用前述稳转细胞系进行功能试验,划痕实验确定HSPA6对GBM细胞迁移能力的改变;CCK-8和克隆形成实验确定HSPA6对GBM细胞增殖能力的影响;Transwell迁移及侵袭实验确定HSPA6对GBM细胞的侵袭与迁移能力的影响。6.IP-MS筛查HSPA6相互作用蛋白通过IP-MS,我们并没有发现HSPA6与PI3K存在直接相互作用,而EGFR与HSPA6具有较强的亲和力,通过Co-IP实验也证实EGFR与HSPA6的结合。在过表达HSPA6细胞系中使用EGFR抑制剂检测过表达HSPA6的GBM细胞增殖、迁移、侵袭能力的变化,在敲低HSPA6细胞中添加外源性EGFR检测GBM细胞的恶性功能。7.数据处理与统计学分析在本项研究中、上述所有统计数据和方法均使用R软件（版本4.0.4,http://www.r-project.org/）、Perl（版本5.24.3）和SPSS 22.0 for windows（SPSS,伊利诺伊州芝加哥,美国）。所有统计结果均以平均值±标准差进行结果展示,p＜0.05代表数据存在明显的统计学差异,用“*”进行表示。其中*:P＜0.05;**:P＜0.01;***:P＜0.005;NS:P＞0.05;结果:1.多个胶质瘤公共数据库的生信分析结果表明HSPA6在胶质瘤组织中上调,且随着肿瘤级别的提高而升高。HSPA6作为促癌基因其表达量对患者的预后效果较为稳定。2.临床胶质瘤组织样本的蛋白质电泳及免疫组化证实HSPA6在GBM中高表达。3.针对HSPA6基因的差异基因分析以及功能富集分析结果表明HSPA6与免疫系统激活密切相关,且与PI3K/Akt信号通路密切相关。4.敲除以及过表达HSPA6能够影响GBM细胞的增殖、迁移、侵袭和凋亡。5.IP-MS和Co-IP结果表明EGFR可与HSPA6相互作用。6.使用EGFR抑制剂能够阻断HSPA6过表达导致的PI3K/Akt信号通路过度激活和GBM细胞的增殖、迁移和侵袭。使用EGFR能够恢复HSPA6敲低导致的PI3K/Akt信号通路抑制和GBM的恶性功能。结论:综合上述实验结果,我们提出HSPA6通过EGFR介导PI3K-Akt通路从而调节GBM细胞的生物学功能并参与调控GBM的进展,HSPA6有可能作为抑制GBM进展的有效治疗靶点。