背景心肌细胞的再生能力有限,目前心脏组织工程为心脏疾病后心肌细胞的修复和再生带来了新的治疗策略。在可移植的种子细胞中,脂肪间充质干细胞(Adipose Mesenchymal Stem Cells, ADMSCs)因其来源广泛、取材方便,伦理限制较少,已成为心肌组织工程理想的种子细胞之一。Atelocollagen胶原具有良好的生物相容性、可降解性和可塑性,可被制成三维立体支架,用作组织填充物和细胞培养支架。目前尚不知道ADMSCs是否可以在Atelocollagen支架上被培养成三维心肌。本研究试图把诱导心肌化的ADMSCs中植在支架上,体外培养成立体心肌。目的探讨小鼠ADMSCs在二维和三维培养条件下,利用不同诱导方法,评价诱导成心肌分化的效果,以及判断三维培养后的ADMSCs在心脏内的存活情况,为心肌组织工程提供实验参考。方法1.取小鼠腹股沟皮下脂肪组织,分离培养ADMSCs,传至第3代后,用CD29+、CD45-标记,流式细胞仪分选ADMSCs。2.使用成脂、成骨诱导培养基诱导ADMSCs,对成骨诱导组行茜素红染色,对成脂诱导组进行油红O染色,检测其多向分化潜能。3.分别利用5-aza和将ADMSCs注射心肌组织内,诱导ADMSCs定向心肌分化,用免疫荧光技术检测心肌特异性标记cTnT的表达情况。4.用DAPI、PKH26、GFP分别标记ADMSCs后种植在Atelocollagen胶原支架上进行三维培养,观察计算不同方法的标记率。5.将ADMSCs种植于三维支架上分别经5-aza和在大鼠心肌组织内的微环境诱导,在不同时间点观察支架上的ADMSCs向心肌分化的情况,用免疫荧光技术检测心肌特异性标记cTnT的表达。观察Atelocollagen胶原支架在心肌内降解时间,检测支架内ADMSCs缝隙连接蛋白Cx43的表达,分析移植的细胞与宿主心肌细胞是否发生功能联系。结果1.分离培养的小鼠ADMSCs,经流式细胞仪检测显示,CD29表达率为94%、而CD45阳性率仅为0.19%,符合目前国际上公认的间充质干细胞表面分子特征,证明所培养的细胞为脂肪来源的间充质干细胞。2.成脂诱导14天,成骨诱导21天后,ADMSCs可分化为脂肪样细胞和骨样细胞,显示ADMSCs具有多向分化潜能。3.5-aza和大鼠体内心肌微环境均可使ADMSCs分化为心肌样细胞,但心肌微环境的诱导分化效率明显高于5-aza组,且具有时间依赖性,体内移植组1周分化效率(42.93±4.04)%大于5-aza组3周的效率(33.33±3.79)%,P<0.05。4. DAPI、PKH26、GFP三种方法标记后的ADMSCs可在Atelocollagen胶原支架上生长并增殖,标记率分别为DAPI(92.7%)、PKH26(89.2%)、GFP(95%)。5.3d时移植的支架内可见极少量ADMSCs,大部分移植细胞迁移至支架外。7d时部分移植细胞cTnT呈阳性,Cx43呈阴性,13d时支架完全降解。支架上的细胞在5-aza诱导和在体内微环境诱导均能使ADMSCs向心肌方向分化。结论 (1)大鼠体内心肌微环境对小鼠ADMSCs定向心肌分化诱导效率高于体外5-aza诱导。(2)ADMSCs可在Atelocollagen胶原支架上良好生长并增殖,体外经5-aza诱导和体内心肌微环境诱导均能使ADMSCs分化为心肌细胞,但移植到心肌内后,支架上细胞迁移至支架外,并部分分化为心肌样细胞。