论文部分内容阅读
β-1,3-1,4-葡聚糖酶(EC3.2.1.73,以下简称β-葡聚糖酶)是啤酒工业和饲料工业中最重要的酶之一,它对含β-葡聚糖功能性食品的研究开发以及人体营养健康也具有重要意义。目前,国内β-葡聚糖酶的生产主要以曲霉和芽孢杆菌的诱变菌株为主,它们的产酶水平或耐热性还不够理想。本研究以前期构建的一株产分泌性较好、酶活性较高、耐热性好的β-葡聚糖酶基因工程菌CA为材料,系统研究了该菌株产β-葡聚糖酶的发酵条件,并就该酶的纯化、酶学特性和酶的保护进行了研究。以TB为初始培养基,以菌体生物量和β-葡聚糖酶活性两个指标综合评价产酶条件,研究得到摇瓶条件的最佳培养基为:蔗糖2g/L、酵母粉20g/L、蛋白胨16g/L、KH2PO42.31g/L、K2HPO4·3H2O12.54g/L、CaCl20.44g/L和吐温800.8%(V/V)。通过单因素和正交实验获得的最佳培养条件为:接种量2%(V/V)、装样量25/250mL和培养基初始pH6.2。经过以上两步优化,工程菌在37℃200r/min培养诱导后,β-葡聚糖酶活性达到720.76±11.00U/mL,较初始的389.59±17.93U/mL提高了85%。在上述优化条件的基础上,分别选择IPTG和乳糖两种诱导剂,确定了不同诱导剂的最佳诱导条件,其中IPTG诱导条件为:接种4h,OD600≈2.5时,添加终浓度为1.4mmol/L的IPTG,并调节温度到41℃,诱导6h;乳糖诱导条件为:接种6h, OD600≈3.8时,添加终浓度为10mmol/L的乳糖,并调节温度到41℃,诱导8h。两种条件下得到的β-葡聚糖酶活性分别是初始条件的2.60和2.52倍。以乳糖为诱导剂能达到IPTG诱导水平的97%,虽然它发酵周期较长,但它安全、经济,可替代IPTG。以乳糖为诱导剂,采用5L发酵罐进行产β-葡聚糖酶的放大实验,在发酵罐分批发酵模式下得到的生物量为3.92±0.05g/L,β-葡聚糖酶活性为1221.26±26.22U/mL,较摇瓶规模的生物量3.14±0.07g/L,β-葡聚糖酶活性988.74±31.14U/mL,分别提高了24.8%和23.5%。为乳糖诱导该工程菌产β-葡聚糖酶的规模化生产提供了基础数据。采用Ni2+金属螯合层析,获得了电泳纯的β-葡聚糖酶。研究了该酶的酶学特性,酶的最适反应温度为70℃,在4060℃之间热稳定性良好,最适反应pH为7.6,在pH68范围内稳定性较高,Ca2+和Fe3+对β-葡聚糖酶的活性有一定的激活作用,Na+的抑制作用最强。采用单因素和正交实验确定了β-葡聚糖酶的复合保护剂配方:牛血清蛋白0.75%(W/V)、甘油4.5%(V/V)和海藻糖0.1%(W/V)。该保护剂能使β-葡聚糖酶的热稳定性在5090℃范围内得到明显改善,并将热降解速度降低2.8倍,显著提高该酶的贮存稳定性。