白藜芦醇(resveratrol,Res)是有多酚结构的化合物,又名芪三酚,广泛分布与自然界中,具有良好的去除自由基和抗氧化的能力,防止基因突变,抗菌消炎,调节人体神经,保护肝脏,防治心血管疾病,甚至能够预防和治疗癌症。经研究表明,白藜芦醇能在癌细胞生长的起始、增殖、发展,这3个主要阶段起到抑制乃至逆转肿瘤细胞的作用。这使白黎芦醇成为一种天然绿色低毒的抗肿瘤物质。白藜芦醇成为联合国少数推荐的保健品之一。但由于白藜芦醇难溶于水,大大降低了其生物利用度,限制了其产品的开发和应用。本实验主要研究了一种利用超临界流体重结晶技术SAS法来制备白藜芦醇超微粉的工艺。该方法使难溶于水的白藜芦醇,在超临界的环境下重结晶,通过调节超临界过程中的各个因素,来控制白藜芦醇晶核的成长,从而减小白藜芦醇粉末的粒径,降低其结晶度,增加比表面积,提高白藜芦醇在水中的溶解度。从而达到提高人体生物利用度的目的。本研究先对制备工艺进行了正交优化。而后,在最佳条件下制备白藜芦醇超微粉样品,并对其形貌、理化性质、纯度、溶出行为、体外抗氧化、果蝇体内抗氧化和药代动力学进行分析。具体研究成果如下:1、利用正交实验对超临界SAS法制备白藜芦醇超微粉工艺优化,得出最佳工艺条件为:反应温度为50°C,反应压力为20Mpa,白藜芦醇乙醇溶液的浓度为9mg/mL,进样速度为1 mL/min。在最佳条件下制备白藜芦醇超微粉的平均粒径为0.68μm±0.03μm。2、超微粉的形貌特征:通过肉眼的仔细观察,我们发现白藜芦醇原粉为无色的晶体粉末,晶针粗大,粉末密度大。而白藜芦醇超微粉则是无色的絮状粉末,粉末蓬松,轻飘,密度小。这也从侧面反映了,白藜芦醇超微粉粒径减小,晶体程度降低。通过电子显微镜观察到,白藜芦醇原粉的显微结构呈长条型晶体柱状结构,晶型完整巨大,粒径大小一·般在几百微米左右,而白藜芦醇超微粉的显微结构为微小的薄片状,没有明显的晶体结构,大小分布均匀,粒径大小一般在几微米左右,甚至更小。因此白藜芦醇超微粉比白藜芦醇原粉拥有更低的晶型结构和更小的颗粒粒径。3、从化学结构和物理结构两方面,对超临界SAS法制备的白藜芦醇超微粉和原粉进行了表征研究。从化学结构研究:经红外光谱检测表明,白黎芦醉在超临界制备过程中,官能团没有发生变化。经质谱检测表明,白藜芦醇的分子量没有发生变化。从物理结构研究:经X衍射检测表明,白藜芦醇超微粉较原粉,结晶度大大降低了。经差式扫描量热法(DSC)检测也表明,白藜芦醇超微粉的结晶程度弱于原粉。经热解重量分析(TGA)检测表明,随着检测温度的上升,白藜芦醇超微粉比原粉失重快,损失重量更多,说明其晶型差,能量大,不稳定。4、纯度:经高效液相色谱检测,白藜芦醇超微粉的纯度为99.2%±0.5(mean±SD),而白藜芦醇原粉纯度为98.5%±0.5(mean±SD)。这说明白藜芦醇在超临界SAS制备过程中,重结晶,并进一步纯化。5、溶出行为:经高效液相色谱检测,白藜芦醇原粉和超微粉在水中的溶解度分别为31.8μg/mL和75.1 μg/mL。在模拟血液pH 7.4磷酸盐缓冲液中的溶解度分别为66.2 μg/mL和29.6μg/mL。白藜芦醇超微粉在水中的溶解度是原粉的2.4倍,在pH 7.4的磷酸盐缓冲液中,是原粉的2.3倍。在白藜芦醇溶出速度实验中,藜芦醇超微粉放入水中不到5min就溶解了89.5%,15min左右就几乎完全溶解了。而白藜芦醇原粉放入水中5min时,仅溶解了 72.6%,在15min时,仅溶解了 77.3%,并趋于平缓,已达上限。这说明白藜芦醇超微粉比原粉有更快的溶出速度。6、体外抗氧化:白藜芦醇体外去除自由基DPPH实验显示,白藜芦醇超微粉的IC50值为7.75 μg/mL,而白藜芦醇原粉的IC50值为14.55 μg/mL。因此白藜芦醇超微粉的去除自由基的能力是原粉的1.9倍。这说明,随着白藜芦醇颗粒粒径的减小,其去除自由的能力大大增加。这是山于随着白藜芦醇颗粒粒径的减小,白藜芦醇的溶解度和溶出速度增加,从而导致了白藜芦醇超微粉的去除自由基的能力高于原粉。7、果蝇体内抗氧化:实验结果表明,在给果蝇喂食维生素E、白藜芦醇超微粉和原粉的溶液浓度为5mg/mL时,这些物质的抗氧化效果最佳。其中,维生素E的果蝇半数死亡时间、平均寿命和最大寿命分别是空白对照组的1.14、1.25和1.16倍。白藜芦醇原粉的果蝇半数死亡时间、平均寿命和最大寿命分别是空白对照组的1.19、1.33和1.19倍。白藜芦醇超微粉的果蝇半数死亡时间、平均寿命和最大寿命分别是空白对照组的1.21、1.35和1.21倍。白藜芦醇超微粉半数死亡时间、平均寿命和最大寿命分别是分别是维生素E和原粉的1.06、1.08、1.05倍和1.02、1.02、1.02倍。这说明白藜芦醇可以延缓果蝇的衰老,延长果蝇的寿命,具有抗氧化活性。并且白藜芦醇的抗氧化效果优于维生素E。而由超临界SAS制备的白藜芦醇超微粉在抗氧化效果最好。8、药代动力学分析:通过高效液相研究白藜芦醇超微粉和原粉在大白鼠体内的生物利用度情况。结果表明白藜芦醇超微粉的血药浓度在15min时达到了最大峰值2.35 μg/mL,在30min时就达到了 1.8 μg/mL,然后在8小时内慢慢降到了 0.01 μg/mL。白藜芦醇原粉的血药浓度,在15min时也达到了最大峰值1.95 μg/mL,然后在8小时内慢慢降到了 0.01 μg/mL。分别计算二者的谱图面积AUC值,结果白藜芦醉超微粉是白藜芦醇原粉的1.9倍。这说明,白藜芦醇超微粉的生物利用度是原粉的1.9倍。再经过药代动力学软件3P87计算,白藜芦醇超微粉的Ka值更大,表明其在生物体内作用的时间更长,半衰期值更大,具有缓释作用。终上所述,利用超临界流体重结晶技术SAS法来制备白藜芦醇超微粉的工艺,成熟,可靠,制备出的白藜芦醇超微粉,粒径小,溶解度大,溶出速度快,抗氧化效果好,生物利用度高。本工艺在不引入其他助溶物质的情况下,大大的改善了白藜芦醇的水溶性,且使其纯度提高,为白藜芦醇的开发利用提供了新的方法和依据。