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肺动脉重塑是肺动脉高压（pulmonary hypertension,PH）的主要病理基础,在肺动脉重塑过程中,肺动脉平滑肌细胞（pulmonaryarterial smoothmuscle cells,PASMCs）的过度增殖及凋亡抑制是肺动脉重塑的特征性病理改变。非编码RNA（noncoding RNA,ncRNA）是一类不具备蛋白编码功能的RNA,包括微小 RNA（microRNA,miRNA）、长链非编码 RNA（long non coding RNA,lncRNA）、环状 RNA（circular RNA,circRNA）等。circRNA 是一种特殊类型的 ncRNA,是 RNA领域中一个最新的研究热点,circRNA与含5’和3’末端的线型ncRNA不同,circRNA的5’头端与3’尾端相连,形成封闭的环状结构,可以抵抗核酸外切酶的降解,比线性RNA更为稳定。circRNA主要通过吸附miRNA发挥基因表达调控作用,circRNA结构中富含miRNA应答元件（miRNA response element,MRE）,可充当竞争性内源RNA（competing endogenous RNA,ceRNA）与 miRNA 结合,吸附 miRNA,在细胞中起到miRNA海绵（miRNA sponge）的作用,下调miRNA的表达,进而解除miRNA对下游靶基因的表达抑制作用,上调靶基因的表达。目前circRNA在肺动脉重塑中的研究甚少,本研究中,我们发现慢性阻塞性肺疾病（chronic obstructive pulmonary disease,COPD）患者外周肺动脉存在明显重塑,且经过circRNA芯片及实时荧光定量PCR检测发现在COPD及非COPD患者外周肺组织中存在明显差异表达的circRNA,其中hsa＿circ＿0045462在COPD患者外周肺组织中显著高表达,进一步通过荧光原位杂交（fluorescence in situ hybridization,FISH）技术定位hsa＿circ＿0045462在外周肺组织中的表达部位,发现其主要表达于外周肺动脉中膜。因此,我们推测hsa＿circ＿0045462可能参与了 COPD肺动脉重塑过程。根据生物信息学预测,hsa＿circ＿0045462与miR-486-5p之间存在互补碱基序列,可能调控miR-486-5p的表达。近期研究表明miR-486-5p可通过调控PASMCs及肺动脉内皮细胞（Pulmonary artery endothelial cells,PAECs）的迁移及细胞间的相互作用参与肺动脉重塑,但具体机制不详。细胞迁移诱导蛋白（cellmigration-inducingprotein,CEMIP）是重要的促癌基因,CEMIP的高表达与多种肿瘤细胞的过度增殖、凋亡抑制及侵袭密切相关。多个研究已经证实 CEMIP 的3’端非编码区（3’UntRNAslated Regions,3’UTR）存在 miR-486-5p的互补碱基序列,miR-486-5p可通过下调CEMIP的表达抑制肿瘤细胞的增殖及迁移、促进其凋亡。那么miR-486-5p能否通过下调CEMIP的表达参与PASMCs的增殖、凋亡调控,目前尚无相关研究报道。因此,我们以人PASMCs为研究对象,通过细胞转染、双荧光素酶实验等方法,初步探讨hsa＿circ＿0045462/miR-486-5p/CEMIP信号轴对PASMCs增殖、凋亡的影响及机制;旨在为肺动脉高压的诊治提供新的靶点,为临床转化应用提供一定的理论基础和依据。第一部分 COPD肺动脉重塑相关circRNA表达谱分析及筛选研究目的初步探索circRNA在COPD患者外周肺动脉中的表达。研究方法1.收集2016年1月至2018年12月在苏州大学附属第一医院因肺减容或肺癌行手术治疗的20例COPD及15例非COPD患者的外周肺组织标本及性别、年龄、吸烟状况、肺功能及动脉血氧分压等临床资料。获取的肺组织标本远离肿瘤（至少5cm）。COPD的诊断符合慢性阻塞性肺疾病诊治指南。2.通过HE染色及免疫组化法（α-SMA）检测COPD及非COPD组患者外周肺动脉管壁厚度与外径的比值及肌化血管比例。3.基因芯片（humancircularRNA array V2.0）检测COPD与非COPD组患者外周肺组织中差异表达的circRNA,并通过实时荧光定量PCR方法进行验证,筛选出目标circRNA,并采用FISH法定位目标circRNA的表达部位。4.通过对差异表达的circRNA亲本基因GO（Geneontology）及KEGG-pathway分析,初步探讨circRNA与COPD肺动脉重塑的关系。研究结果1.与非COPD组相比,COPD组患者外周肺动脉管壁厚度与外径的比值显著增高（p＜0.001）、肌化血管比例显著增高（p＜0.001）。2.与非COPD组相比,COPD组患者外周肺组织中circRNA的表达存在明显差异,共有表达下调的circRNA 130条,表达上调的circRNA 97条;经实时荧光定量PCR验证,选取的 4 条表达最高的 circRNA 中 hsa＿circ＿0002970（p＜0.01）,hsa＿circ＿0008199（p＜0.01）以及hsa＿circ＿0045462（p＜0.001）在COPD患者外周肺组织中的表达均较非COPD组增高,其中hsa＿circ＿0045462高表达最为显著。而hsa＿circ＿0004893的表达两组间无显著差异（p＞0.05）。3.荧光素标记的hsa＿circ＿0045462与α-SMA在COPD患者外周肺组织中的表达部位基本一致,提示hsa＿circ＿0045462主要表达于外周肺动脉中膜。4.circRNA亲本基因GO及KEGG pathway分析提示差异表达的circRNA可能与核酸代谢、蛋白代谢、细胞周期及有丝分裂调控等过程有关。研究结论1.COPD患者存在明显的肺动脉重塑。2.Hsa＿circ＿0045462在COPD患者外周肺动脉中膜表达升高,可能与COPD肺动脉重塑相关。第二部分 Hsa＿circ＿0045462/miR-486-5p/CEMIP 在低氧诱导的人PASMCs增殖、凋亡调控中的作用研究目的探讨hsa＿circ＿0045462在低氧诱导的人PASMCs增殖调控中的作用及机制。研究方法1.通过实时荧光定量PCR检测低氧诱导的人PASMCs中hsa＿circ＿0045462的表达;CCK-8检测PASMCs的增殖,TUNEL检测PASMCs的凋亡。2.通过生信预测hsa＿circ＿0045462与miR-486-5p存在调控关系,并行双荧光素酶实验验证。3.采用 hsa＿circ＿0045462 特异性小干扰 RNA（si-has＿circ＿0045462）转染低氧诱导的 PASMCs;荧光定量 PCR 检测 hsa＿circ＿0045462、miR-486-5p 的表达;CCK-8 检测PASMCs的增殖,TUNEL检测PASMCs的凋亡。4.通过生信预测miR-486-5p与CEMIP存在调控关系,并行双荧光素酶实验验证。5.采用 miR-486-5p mimics、miR-486-5p inhibitor 转染 PASMCs,Western Blot 法检测CEMIP的表达;CCK-8检测PASMCs的增殖,TUNEL检测PASMCs的凋亡。6.采用 si-circ＿0045462及 miR-486-5p inhibitor 共同转染低氧诱导的 PASMCs;Edu检测PASMCs的增殖,TUNEL检测PASMCs的凋亡;Western Blot法检测CEMIP的表达。研究结果1.低氧组（O2:3%,24h）PASMCs的增殖较常氧组（O2:21%,24h）显著增加（p＜0.001）,凋亡显著减少（p＜0.001）。2.低氧组（O2:3%,24h）PASMCs 中 hsa＿circ＿0045462 的表达较常氧组（O2:21%,24h）显著升高（p＜0.001）。3.双荧光素酶实验结果显示:与miR-NC组相比,miR-486-5p共转染组PASMCs中,hsa＿circ＿0045462-WT的相对荧光素酶活性显著下降（p＜0.01）,而hsa＿circ＿0045462-MT的相对荧光素酶活性无显著变化（p＞0.05）。4.在低氧（O2:3%,24h）诱导的 PASMCs 中干扰 hsa＿circ＿0045462 的表达后,miR-486-5p的表达显著升高（p＜0.01）,PASMC的增殖显著减少（p＜0.001）、凋亡显著增加（p＜0.001）。5.双荧光素酶实验结果显示:与miR-NC组相比,miR-486-5p共转染组PASMCs中,CEMIP-WT的相对荧光素酶活性显著下降（p＜0.01）,而CEMIP-MT的相对荧光素酶活性无显著变化（p＞0.05）。6.低氧组（O2:3%,24h）PASMCs中miR-486-5p的表达较常氧组显著下降（p＜0.001）;miR-486-5pmimics 转染后,PASMCs 增殖显著减少（p＜0.001）,凋亡显著增加（p＜0.001）。7.CEMIP在低氧（O2:3%,24h）诱导的PASMCs中的表达显著升高（p＜0.001）;miR-486-5p mimics 转染后,CEMIP 的表达显著降低（p＜0.001）,而 miR-486-5p inhibitor转染作用相反（p＜0.001）。8.在低氧（O2:3%,24h）诱导的 PASMCs 中,miR-486-5p inhibitor 能逆转has＿circ＿0045462 干扰引起的 PASMCs 增殖抑制（p＜0.001）、凋亡增加（p＜0.001）以及CEMIP的表达下降（p＜0.001）。研究结论1.低氧可通过上调hsa＿circ＿0045462在PASMCs中的表达,促进PASMCs增殖,抑制PASMCs凋亡。2.Hsa＿circ＿0045462可通过ceRNA机制下调miR-486-5p的表达,促进低氧诱导的PASMCs增殖、抑制其凋亡。3.CEMIP是miR-486-5p调控PASMCs增殖、凋亡的靶点。第三部分 CEMIP在低氧诱导的人PASMCs增殖、凋亡调控中的作用及机制研究目的CEMIP在低氧诱导的人PASMCs增殖、凋亡调控中的作用及其调控机制研究方法1.通过实时荧光定量PCR及Western Blot检测PASMCs中CEMIP的表达。2.采用CEMIP特异性小干扰RNA（si-CEMIP）转染低氧诱导的PASMCs,并通过 Western Blot 检测 PASMCs 中 CEMIP 的表达;Edu 检测 PASMCs 的增殖,TUNEL检测PASMCs的凋亡。3.通过Western Blot检测低氧诱导以及si-CEMIP转染的PASMCs中pAKT、cyclinD1及c-IAP2 的表达。4.采用 Western Blot 检测 si-hsa＿circ＿0045462 转染后 PASMCs 中 CEMIP、pAKT的表达。研究结果1.低氧组PASMCs中CEMIP mRNA（O2:3%,24h）的表达较常氧组显著升高（p＜0.001）;CEMIP 蛋白（O2:3%,24h、48h）的表达较常氧组显著升高（p＜0.05）。2.在低氧（O2:3%,24h）诱导的PASMCs中干扰CEMIP的表达后,PASMCs增殖显著减少（p＜0.001）、凋亡显著增加（p＜0.001）。3.低氧组（O2:3%,24h）PASMCs 中 pAKT（p＜0.001）、cyclinD1（p＜0.001）及c-IAP2（p＜0.001）的表达较常氧组显著升高;而干扰CEMIP表达后,pAKT（p＜0.001）、cyclinD1（p＜0.001）及 c-IAP2（p＜0.001）的表达显著降低。4.在低氧（O2:3%,24h）诱导的PASMCs 中干扰hsa-circ＿0045462 的表达后,CEMIP（p＜0.001）及pAKT（p＜0.001）的表达均显著降低。研究结论1.CEMIP可能通过激活AKT信号通路,促进低氧诱导的PASMCs增殖、抑制其凋亡。2.Hsa＿circ＿0045462通过ceRNA机制下调miR-486-5p的表达,上调CEMIP的表达,并通过激活AKT信号通路,促进低氧诱导PASMCs增殖、抑制PASMCs凋亡。