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研究背景:脑血管疾病(cerebrovascular disease,CVD)是世界范围内成人致残的首要因素和第三位人口死亡的病因,也是老年人认知功能障碍和情感障碍的重要原因之一。由中国疾病预防控制中心2012年发布的国家卫生统计数据指出,我国为CVD的高发国家,CVD的发病率由2003年的6.6‰上升到2008年的9.7‰,2011年CVD的城镇人口死亡率为138.68/10万,是我国人口死亡的第二位原因。脑卒中(stroke)是指急性起病、迅速出现局限性或弥漫性脑功能缺失征象的脑血管性临床事件。脑梗塞(cerebral infarction,CI)又称缺血性脑卒中(cerebral ischemic stroke,CIS)是由于脑部血液供应障碍,缺血、缺氧引起的局限性脑组织的缺血性坏死或脑软化,约占全部脑卒中的80%。血管内皮损伤,导致血小板和炎性细胞在内皮损伤部粘附、聚集,最终形成血栓是脑梗塞发生的主要原因。血管性血友病因子(von Willebrand factor,VWF)是一种大分子量的具有粘附功能的多聚体糖蛋白,其在止血与血栓过程中发挥着重要的作用。当血管壁受损时,VWF作为血小板膜糖蛋白(glycoprotein,GP)Ib与受损内皮细胞上的胶原之间的桥梁,可以介导血小板粘附到血管壁上。近年来,越来越多的研究证明高水平的VWF和低水平的血管性血友病因子裂解蛋白酶(ADAMTS13)与缺血性脑卒中的发生发展有关,而且VWF介导的新型血小板粘附和激活的拮抗剂,作为一种更强大、安全的抵抗血栓形成紊乱的药物,也受到越来越多的关注。我室曾研制了一套操作简单、特异性强、敏感性高的ELISA试剂盒用于检测血浆中的VWF抗原含量(VWF:Ag)、VWF瑞斯托霉素辅因子活性(VWF:Rcof)及VWF胶原结合能力(VWF:CB)。本研究使用这些ELISA试剂盒检测脑梗塞患者血浆中的上述指标,并结合ADAMTS13活性(ADAMTS13)检测、VWF多聚体电泳分析,为中国人群中的脑梗塞患者的分子病理机制研究提供更可靠的依据。目的:本研究旨在通过制备重组血小板糖膜蛋白Ibα-Fc融合蛋白(包含Ig G Fc段,rf GPIbα-Fc),并检测脑梗塞患者和正常对照组血浆中的VWF:Ag、VWF:Rcof、VWF:CB和ADAMTS13,分析这些指标之间的比值VWF:Rcof/VWF:Ag,VWF:CB/VWF:Ag,ADAMTS13/VWF:Ag,ADAMTS13/VWF:Rcof,ADAMTS13/VWF:C B,并结合VWF多聚体电泳分析,进一步了解VWF及ADAMTS13在脑梗塞的发生发展中的作用。方法:(1)用CHO细胞培养表达rf GPIbα-Fc蛋白,用亲和层析柱纯化rf GPIbα-Fc,并用ELISA、10%SDS-PAGE电泳、Werstern blot方法检测其纯度和免疫学活性。(2)收集苏州大学附属第一医院神经内科住院的94例脑梗塞患者血浆作为病例组和103例正常志愿者的血浆作为对照组。(3)采用ELISA方法检测VWF:Ag、VWF:Rcof、VWF:CB水平,用荧光标记VWF73底物荧光共振能量转移试验(FRETS-VWF73)检测ADAMTS13活性。(4)应用SPSS 20.0和Med Calc 13.2.2.0.统计软件分析上述指标及它们之间的比值与脑梗塞的关系。(5)利用VWF多聚体电泳分析病例组及对照组血浆中的VWF多聚体形态。结果:(1)成功制备富含rf GPIbα-Fc的细胞上清并获得高活性的rf GPIbα-Fc纯化产物。(2)脑梗塞病例组的血浆VWF:Ag(M[IQR],176%[114%-293%])、VWF:Rcof(197%[105%-381%])水平高于对照组(105%[61%-145%];100%[60%-175%],P<0.001);病例组ADAMTS13(109%[80%-132%])、VWF:CB/VWF:Ag(0.43[0.28-0.90])、ADAMTS13/VWF:Ag(0.54[0.32-0.99])和ADAMTS13/VWF:Rcof(0.57[0.29-0.91])水平明显低于对照组(117%[103%-146%];1.13[0.72-1.81];1.23[0.79-2.16];1.18[0.71-1.79],P<0.01)。高水平的VWF:Ag(OR=5.11,95%CI,1.49-17.50),VWF:Rcof(OR=5.04,95%CI,1.62-15.66)和低水平的VWF:CB/VWF:Ag(OR=5.91,95%CI,1.95-17.93),ADAMTS13/VWF:Ag(O R=9.11,95%CI,2.49-33.33),ADAMTS13/VWF:Rcof(OR=3.73,95%CI,1.39-10.03)与脑梗塞的发生有关。(3)VWF多聚体电泳分析病例组与对照组的VWF多聚体形态无明显差别。结论:(1)获得了具有较高纯度和活性的rf GPIbα-Fc蛋白。(2)血浆中高水平的VWF:Ag、VWF:Rcof及低水平的VWF:CB/VWF:Ag、ADAMTS13/VWF:Ag、ADAMTS13/VWF:Rcof与脑梗塞的发生有关;(3)脑梗塞病人血浆中仅为VWF量的异常,而无VWF多聚体形态的异常。(4)联合应用VWF:Ag、VWF:Rcof、VWF:CB/VWF:Ag、ADAMTS13/VWF:Ag、ADAMTS13/VWF:Rcof可以更清楚的了解VWF与脑梗塞的关系,并为以后临床应用VWF靶向药物提供参考指标。