1研究背景和目的机械通气(MV)已成为救治呼吸衰竭的重要手段之一,但其本身也可诱发或加重原有的肺损伤,导致机械通气肺损伤(VILI)。VILI的组织病理学改变和其他原因引起的肺损伤相似,均伴有肺泡上皮和血管内皮的广泛性破坏、肺泡毛细血管膜通透性增加、肺水肿、出血、透明膜形成和炎性细胞浸润等病理学改变。自1974年,webb等人最早提出机械通气能导致肺损伤这一概念至今[2], VILI日益受到人们的关注,近年来对VILI的发病机制进行了大量的研究。目前认为VILI主要是由于高气道峰压和大潮气量通气导致吸气末肺组织过度扩张,以及不张的终末小气道或肺泡随机械通气周期性开放和关闭所引起的机械性肺损伤,此外,在机械性损伤的基础上,肺内炎症细胞聚集、活化和释放炎性介质可进一步促进VILI的发生和发展。根据VILI的损伤类型,一般将VILI大致分为以下几种类型,即气压伤、容量伤、不张伤和生物伤。其中前两者属于机械性损伤,一般早期首先出现机械性损伤,随后以炎症细胞、细胞因子介导的生物伤为主,两者相互联系,生物伤作用重要,机制复杂,成为VILI的研究热点。大量研究表明,机械通气产生的异常增高的牵张、剪切力等机械刺激作用于肺细胞,导致肺细胞内众多信号转导信号激活如MAPK通路、NF-κB系统以及细胞膜表面的牵拉敏感性离子通道,使各种炎性细胞如TNF-α IL-1β、IL-8等表达增多引起白细胞向肺组织浸润,这些炎症细胞和细胞因子相互作用,构成一个庞大且复杂的网络体系,不但能直接导致肺组织损伤,还可通过血液循环释放到全身各个组织器官,引起多器官功能障碍(MODS)甚至危及生命。虽然在过去几十年内对VILI的发病机制有了大量的研究也取得了显著的成果,但是其确切机制目前并不是很清楚。最近有人提出机械通气肺损伤可能存在昼夜节律性,这为VILI的机制研究开辟了一条新的道路。昼夜节律是所有生物体对可预测的环境改变的一种综合性的适应,它是可以持续运行并且以大约24h为周期的生物节律,是生物界最普遍的一种生物节律,与许多生理和行为过程有关,如睡眠-觉醒周期、激素水平、体温、血压、呼吸等。昼夜节律的中枢在下丘脑视交叉上核,也存在于机体的各个组织器官,肺组织也不例外。研究显示,人体正常肺功能具有明显的昼夜节律性,潮气量、分钟通气量、平均吸气速率以及呼吸效率等均存在昼夜节律性变化,时钟基因在正常肺组织中呈规律表达以调节正常肺功能。更有研究表明,一些呼吸系统疾病如呼吸道感染、哮喘、非小细胞肺癌等同样也具有一定的昼夜节律性。那么,作为呼吸系统相关疾病的VILI是否也具有昼夜节律性呢?目前国内外鲜有报道。因此,本研究主要从昼夜节律这个新视角来探讨VILI的发病机制,以期为VILI的防治提供一种新思路和药物作用新靶点。2材料和方法2.1第一章：机械通气肺损伤大鼠肺组织中核内受体Rev-erba表达改变清洁级同批SD大鼠,体重180-220g,24只,由中山大学实验动物中心提供。随机分为3组(n=8)：F组(自由呼吸组)、LV组(小潮气量组)、HV组(大潮气量组),在光照-黑暗(Light-dark, LD)交替条件下饲养,动物房温维持在20±2℃。采用LD光制(12h：12h)即12小时光照(光照期08：00-20：00)与12小时黑暗(黑暗期20:00-08：00)交替,适应性饲养2周后开始实验。所有大鼠均用10%的水合氯醛0.35g/100g腹腔注射麻醉,仰卧位固定,行右颈总动脉、尾静脉置管术,右颈总动脉置管。待大鼠对口咽部刺激无反应后经口直视下插入14号静脉套管针作为气管导管,血压稳定后,从尾静脉缓慢推入维库溴胺(0.2mg/ml,生理盐水稀释)0.6mg/kg,自主呼吸消失后,连接小动物呼吸机行机械通气。其中F组插管后不给肌松药不行机械通气让大鼠自主呼吸,LV组给予10ml/kg小潮气量行机械通气,HV组给予40ml/kg大潮气量行机械通气,通气时间为2h,机械通气过程中维持泵入维库溴胺(0.2mg/ml)20ml/kg/h。通气完毕后,待自主呼吸恢复平稳即停止通气,拔除气管导管以及动静脉套管针,动脉结扎止血,静脉压迫止血,肌肉和皮肤对应缝合,置大鼠于动物房中单笼饲养。24小时后取大鼠肺组织检测各组肺湿干重比值；HE染色观察各组肺组织病理改变；RT-PCR和Western blot方法检测Bmal1、Clock、Per2、 Rev-erba等时钟基因mRNA和蛋白表达水平。2.2第二章：特异激动剂SR9009对大潮气量机械通气肺损伤大鼠的治疗效果清洁级同批SD大鼠,体重180-220g,16只,由中山大学实验动物中心提供。随机分为2组(n=8):control组、SR9009组,在光照-黑暗(Light-dark, LD)交替条件下饲养,动物房温维持在20±2℃。采用LD光制(12h：12h)即12小时光照(光照期08：00-20：00)与12小时黑暗(黑暗期20：00-08：00)交替,适应性饲养2周后开始实验。其中SR9009组在麻醉前腹腔注射50mg/kg SR9009,control组注射等量稀释液DMSO,30min后两组大鼠均用10%的水合氯醛0.35g/100g腹腔注射麻醉,仰卧位固定,行右颈总动脉、尾静脉置管术,右颈总动脉置管。待大鼠对口咽部刺激无反应后经口直视下插入14号静脉套管针作为气管导管,血压稳定后,从尾静脉缓慢推入维库溴胺(0.2mg/ml,生理盐水稀释)0.6mg/kg,自主呼吸消失后,连接小动物呼吸机行机械通气。两组均采用大潮气量机械通气,呼吸机参数设置为：VT=40ml/kg,f=40次／分,I：E=1：1.5,通气时间为2h,机械通气过程中维持泵入维库溴胺(0.2mg/ml)20ml/kg/h。通气完毕后,待自主呼吸恢复平稳即停止通气,拔除气管导管以及动静脉套管针,动脉结扎止血,静脉压迫止血,肌肉和皮肤对应缝合,置大鼠于动物房中单笼饲养。24小时后取大鼠肺组织检测各组肺湿干重比值；HE染色观察两组肺组织病理改变；Elisa实验对比两组肺组织TNF—α含量变化。3结果3.1第一章结果3.1.1大鼠肺组织病理改变肺组织病理结果显示,自由呼吸组大鼠肺脏外观正常,光镜下可见肺组织结构完整、肺泡腔清晰、肺泡间质无水肿,无炎性浸润改变；小潮气量组大鼠肺脏外观略显肿胀,但表面色泽基本正常,光镜下可见轻度肺间质水肿和少量巨噬细胞、淋巴和单核细胞等炎症细胞浸润；大潮气量组大鼠肺脏外观明显肿胀,表面可见点状出血,光镜下可见弥漫性肺间质水肿,肺泡腔、血管旁和支气管周围有大量炎性细胞浸润,肺泡间隔明显增厚。3.1.2肺湿干重比值肺湿干重比值(W/D值)是评价肺水肿的指标,与对照组比较,小潮气量组大鼠肺组织W/D值略微增加；与对照组、小潮气量两组相比,大潮气量组大鼠机械通气2h后,W/D值明显增加,(P<0.05),说明大潮气量组机械通气后造成严重肺水增多,肺水肿。3.1.3Bmal1、Clock、Per2、Rev-erba等时钟基因mRNA表达水平与自由呼吸组和小潮气量组相比,大潮气量组大鼠肺组织Bmal1、Clock基因mRNA略微升高但无显著性差异；Per2基因mRNA略微下降但无显著性差异。与自由呼吸组相比,小潮气量组Rev-erbα基因mRNA呈显著性下降,且有统计学意义(P<0.05),与自由呼吸组和小潮气量组相比,大潮气量组大鼠肺组织Rev-erbα基因mRNA呈显著性下降,且有统计学意义(P<0.05)。3.1.4Rev-erbα蛋白表达水平与自由呼吸组相比,小潮气量组大鼠肺组织Rev-erbα蛋白产物表达轻微下调,大潮气量组表达显著下调,且有统计学意义(P<0.05)。3.1.5炎症因子TNF-α浓度变化与自由呼吸组相比,小潮气量组大鼠肺组织TNF-α表达显著上调,P<0.05；大潮气量组表达显著上调,P<0.001。3.2第二章结果3.2.1肺组织病理学检测结果Control组大鼠肺组织与大潮气量组机械通气大鼠肺组织改变相似,大鼠肺脏外观明显肿胀,表面可见点状出血,光镜下可见肺泡腔、血管旁、支气管周围有大量炎性细胞浸润,肺泡壁增厚,弥漫性肺间质出血和水肿；SR9009组大鼠肺脏外观略显肿胀,但表面色泽基本正常,光镜下可见少量炎症细胞浸润和轻微肺水肿,与小潮气量组机械通气大鼠肺组织改变相似。该结果说明SR9009能明显减轻大潮气量机械通气大鼠肺损伤程度并有效改善肺组织炎症反应。3.2.2肺组织TNF-α含量与Control组比较,大鼠肺组织TNF-α表达水平明显降低,且有统计学意义(P<0.05)。该结果说明SR9009能明显降低大潮气量机械通气大鼠肺组织肿瘤坏死因子α水平,减轻肺组织炎症反应。4结论(1)大潮气量机械通气时由于机械牵拉导致肺泡上皮细胞损伤或坏死,并诱导肺内炎性细胞因子的释放,从而导致机械通气肺损伤,本研究成功模拟了大潮气量所致机械通气肺损伤动物模型；(2)大鼠机械通气所致肺损伤可能发生肺组织昼夜节律紊乱；Rev-erbα在大鼠机械通气肺损伤中发挥重要作用；(3) Rev-erbα蛋白特异激动剂SR9009对机械通气肺损伤具有良好的治疗效果,能显著减轻大潮气量机械通气大鼠肺损伤程度,降低大潮气量所致TNF-a水平,减轻肺组织炎症反应。