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癌症是全球第二大死亡原因,进行早期诊断和寻找适合的治疗方案对提高患者生存率和预后具有重要意义。目前,通过靶向肿瘤细胞过表达或者特异性表达的靶标分子的靶向治疗方案被认为是最有前景的治疗策略。然而,肿瘤细胞的异质性和突变性往往导致靶向治疗的失败,并且靶标分子的表达存在很大的个体差异,单一的靶点在治疗过程中易发生脱靶现象,迫切需要丰富肿瘤多靶点治疗的新靶点。糖胺聚糖（Glycosaminoglycans,GAGs）广泛分布在哺乳动物细胞表面和细胞外基质中,其合成不受模板驱动,具有高度的时空特异性,异常表达与肿瘤的发生密切相关,是一种潜在的靶点。本论文以rVAR2基因序列为模板进行随机突变,经噬菌体展示技术构建突变体库,以肿瘤GAGs（如HepG2-GAGs）为靶标分子,建立了专一性筛选特异性识别肿瘤GAGs特殊结构探针的新方法,在对探针的特异性和识别表位的结构特征进行深入研究的基础上,进一步探究了探针在癌症诊断和治疗方面的潜在应用价值。主要成果概述如下:1.肿瘤细胞GAGs结合探针的筛选及其特异性分析:为了筛选特异性识别肿瘤细胞GAGs的探针,我们建立一种新的策略。rVAR2基因序列经易错PCR聚合酶随机突变构建突变体基因文库,用噬菌体展示技术表达突变体,利用固定有HepG2-GAGs的磁珠进行高通量定向筛选。经多轮淘选获得的突变体的基因,用大肠杆菌系统表达后,用结合能力分析实验研究突变体克隆对HepG2-GAGs的结合能力,选择结合能力最强的突变体,进一步在分子水平上进行与不同商品化GAGs的结合能力分析,并对其基因序列进行测序,比较与模板蛋白基因序列的差异,研究其改变的序列对结合能力的影响。最终,我们获得了一个与Hep特异性结合的突变体蛋白,将其命名为VAR2HP。SPR分析结果显示VAR2HP与Hep亲和常数达到38 nM,与HepG2-GAGs亲和常数达到30 nM。VAR2HP基因序列含有1953 bp,编码651个氨基酸,理论分子量为73.07 KDa。与 rVAR2 相比,增加了一段氨基酸序列 L292C293Y294T295D296K297L298E299L300N301 和一个N312,两者共同促进了 VAR2HP对Hep的特异性结合。VAR2HP的成功获得,表明通过对已鉴定的GAGs识别探针基因序列进行随机突变,定向筛选具有其他GAGs特异结合能力的探针的策略是可行的,具有重要的实用价值。2.VAR2HP识别表位的结构特征分析:由于从细胞难以获得足够量的HepG2-GAGs用于精细结构分析,本研究利用同样可以与VAR2HP高亲和力相互作用的商品化Hep进行VAR2HP识别表位的结构特征分析。首先,Hep被部分酶解并结合凝胶过滤层析,制备一系列不同聚合度的Hep寡糖（UDP2到UDP16）,竞争性抑制分析表明,UDP10是可以强烈抑制VAR2HP与Hep结合的最小聚合度寡糖。随后,Hep的UDP10组分被利用阴离子交换HPLC进一步分离,获得了 11个电荷密度依次升高的亚组分（P10-1到P10-11）。竞争性抑制实验表明,随着电荷密度的增加,这些亚组分对VAR2HP与Hep结合的抑制力逐渐增强,直至P10-7抑制力增加显著趋缓甚至出现波动,该结果意味着P10-7是可以与VAR2HP高亲和力相互作用的带有最低电荷密度的最小Hep结构。对11个十糖亚组分的二糖组成分析表明,三硫酸化二糖Hex2S（1-4）GlcNS6S随着寡糖电荷密度的增加而增加。最后,我们对能够与VAR2HP高亲和力结合的携带最少电荷的P10-7进行酶法测序,其基本序列为 HexA（l-4）GlcNS-HexA2S（1-4）GlcNS6S-HexA（1-4）GlcNS6S-HexA2S（1-4）GlcNS6S-HexA2S（1-4）GlcNS6S,表明 VAR2HP 能够识别 Hep 的最小表位是至少含有三个不连续三硫酸化Hex2S（1-4）GlcNS6S的十糖。这与已鉴定的识别Hep/硫酸乙酰肝素（HS）链的探针识别的表位不同,说明VAR2HP是一种特异性识别Hep/HS的新型探针。3.VAR2HP识别表位在细胞表面以及体内的表达情况研究:为了比较VAR2HP表位在正常细胞和肿瘤细胞表面的表达情况,我们首先对VAR2HP进行了生物素化（VAR2HP-Bio）和荧光标记（VAR2HP-FITC）,并以之为探针分别利用细胞ELISA和流式细胞仪分析了 VAR2HP在各种固定化细胞和活细胞表面的结合情况。结果表明,VAR2HP与正常细胞结合较弱,而与多种肿瘤细胞强结合,并且VAR2HP在肿瘤细胞表面的结合可以被肝素酶（Heparinases,Hepases）对细胞预处理或者添加外源Hep强烈抑制,表明肿瘤细胞表面表达的Hep样结构卷入了与VAR2HP的结合。进一步,我们利用激光共聚焦实验对VAR2HP在肿瘤细胞表面与Hep样结构的特异性结合进行了可视化分析和确证。以上结果表明VAR2HP识别的Hep样表位能在多种肿瘤细胞中高表达,VAR2HP是一种潜在的针对不同肿瘤细胞的广谱型探针。我们对不同细胞表达的GAGs中HS的二糖组成进行了分析,结果显示,被分析的各种细胞所表达的HS中均含有Hex2S（1-4）GlcNS6S,但是可以与VAR2HP强烈结合的各种肿瘤细胞中表达了更高含量Hex2S（1-4）GlcNS6S,表明细胞中三硫酸化Hex2S（1-4）GlcNS6S的表达量是决定VAR2HP结合能力的重要因素之一。为了进一步研究VAR2HP表位在体内的表达情况,我们首先将VAR2HP-FITC经尾静脉注射到小鼠体内,通过观察各个器官的荧光强度研究VAR2HP表位在体内各器官的表达和分布情况。结果显示VAR2HP-FITC在复杂的体内环境中存在6小时以上仍然具有结合体内器官的能力,与体内肝脏、胃、肠道结合较强,对心脏、肾脏、脾脏结合较弱。而经过Hepases预处理的小鼠,在注射VAR2HP-FITC后,与各个器官的荧光染色明显减弱,而CSase ABC预处理对小鼠各器官的荧光染色无明显抑制,表明VAR2HP识别表位在多种器官中有不同的表达和分布,VAR2HP在复杂的体内环境中仍然能够保持特异性识别Hep样结构的生物活性,是一个稳定的蛋白探针。随后,通过提取各器官中的GAGs,并分析其中Hep/HS的二糖组成,我们发现肝脏、肾脏和胃中表达的Hep/HS含有相对更多的三硫酸化二糖Hex2S（1-4）GlcNS6S,这与VAR2HP倾向于结合肝脏、肾脏和胃及肠道的结果吻合,表明这些器官中含有更多能被VAR2HP识别的表位。接下来,为了研究VAR2HP对体内肿瘤的靶向性,VAR2HP-FITC经尾静脉注射到用鼠源乳腺癌细胞系4T1细胞构建的肺部荷瘤小鼠体内,活体成像结果显示VAR2HP在肝脏、肠道区域和成瘤的肺部区域荧光强度较高,取其肺部进行荧光强度检测,结果显示肺部肿瘤结节部分的荧光强度明显高于其癌旁组织,表明VAR2HP有望成为在体内复杂生理环境下选择性靶向肿瘤的探针和抗肿瘤药物载体。4.VAR2HP在靶向治疗方面的应用潜力初探:为了研究VAR2HP作为药物载体通过靶向肿瘤细胞中过表达的Hep样表位从而提高药物抗肿瘤活性的作用,我们首先分析了 VAR2HP作为药物载体结合细胞后的内吞情况,激光共聚焦分析结果显示,VAR2HP能够快速结合到细胞表面,并在45 min内化入细胞核,具有作为药物载体携带药物进入靶细胞的潜力。随后,我们将VAR2HP与广谱性抗癌药物盐酸阿霉素（Doxorubicin hydrochloride,DOX）进行偶联（VAR2HP-DOX）,采用流式细胞术分析了 VAR2HP-DOX对肿瘤细胞的靶向性,结果显示VAR2HP-DOX能够在10 min内快速结合到细胞,尽管VAR2HP-DOX中DOX的含量仅仅相当于DOX组的十分之一,但其荧光强度显著高于DOX组,表明VAR2HP能够促进药物在肿瘤细胞富集。随后,我们分析了VAR2HP、VAR2HP-DOX以及DOX对不同细胞活力的影响,MTT结果显示VAR2HP单独作用于多种细胞系时,可以微弱地抑制细胞增殖,对肿瘤细胞抑制效果更好。DOX对所有测试细胞无论正常还是肿瘤细胞都有强致死作用,但是对4T1细胞的致死效果更明显。VAR2HP-DOX对正常细胞致死作用明显低于肿瘤细胞,作用24h时,VAR2HP-DOX对4T1细胞的IC50值达到（18.83±1.66）μg/ml,与DOX组相比其DOX的用量降低了30倍,而对正常细胞HEK 293T在该实验浓度下无法计算IC50值。以上研究结果表明,VAR2HP作为药物载体,对肿瘤细胞具有很好的靶向性,有利于减小药物对正常细胞的损伤。为了进一步研究VAR2HP-DOX在体内的抗肿瘤活性,对皮下接种4T1的荷瘤小鼠进行VAR2HP、VAR2HP-DOX以及DOX给药处理,结果显示VAR2HP-DOX能够显著抑制肿瘤生长,与DOX组相比,VAR2HP-DOX组在DOX剂量减少16倍的情况下仍然能达到同DOX组相似的治疗效果,并且在治疗过程中,注射VAR2HP-DOX的实验组,小鼠体重减轻明显低于DOX组,表明VAR2HP-DOX通过特异性靶向肿瘤组织能够明显减轻对正常组织的损伤,是一种可用于肿瘤靶向治疗的理想药物载体。5.VAR2HP在肿瘤诊断方面的初步分析:我们利用生物素化VAR2HP-Bio作为探针对来自临床的不同肿瘤组织石蜡切片进行免疫组化染色分析,结果显示VAR2HP-Bio对肝癌和乳腺癌组织的染色显著强于癌旁组织,并且该染色可以被添加的外源Hep竞争性抑制,表明VAR2HP识别的Hep样表位在临床肝癌和乳腺癌组织中过表达,可以作为肿瘤诊断和靶向治疗的潜在靶标分子。进一步,我们调查了 VAR2HP表位在临床肝癌病人血清中的表达情况及作为靶标分子用于肝癌诊断的可能性。首先,我们用固定VAR2HP的Sepharose 4 Fast Flow分离正常人（NL）、肝炎患者（CH）、肝细胞癌患者（HCC）临床血清样本中的Hep/HS并进行二糖组成分析,结果显示HCC患者血清中总 Hep/HS 含量达到 331.61 μg/ml,显著高于 NL 组（192.20 μg/ml）和 CH 组（197.29μg/ml）,并且只有HCC血清中具有可以与VAR2HP特异性结合的Hep样结构,含量达到36.28 μg/ml,表明HCC患者血清中不仅Hep/HS过表达,而且存在能被VAR2HP识别的表位,有望作为血清标志物用于HCC的诊断。基于以上发现,我们建立了一种基于能量共振转移（Fluorescence resonance energy transfer,FRET）原理进行肝癌诊断的诊断方法,通过检测VAR2HP-FITC与不同临床血清样本预混合后被GO淬灭后残留的荧光强度差异对血清中的VAR2HP识别表位定量,从而进行HCC诊断。结果显示HCC患者残留的荧光强度高于NL和CH,当HCC血清经Hepases处理后,残留荧光强度显著下降,表明HCC患者血清中含有更多的VAR2HP表位,与之结合后抑制了 GO对VAR2HP-FITC的淬灭。为了便于计算该方法的检出率,我们以VAR2HP-FITC在PBS缓冲液中被GO淬灭后残留的荧光强度为对照,实验组数据用相对于对照组的增长倍数表示,以CH血清残留荧光强度增长倍数加上两倍标准差作为HCC检出下限,检出率达到59.97%,临床上目前使用的HCC诊断血清标志物Glypican-3和AFP检出率也在60%左右,表明血清中特殊结构的Hep/HS能够作为HCC诊断的新靶点,并且利用该靶点进行HCC诊断是可行的,本文为HCC诊断提供了一种新的检测方法。综上所述,本论文建立了一种可以专门用于肿瘤相关GAGs特异性探针筛选的新策略和技术平台,利用该平台可以以已知的具有GAGs结合能力的蛋白为模板,通过随机突变,结合噬菌体展示和靶标GAGs的定向淘选,实现对已有GAGs探针的特异性优化的同时有目的筛选具有特异结构的GAGs的特异性探针,不仅可以满足复杂GAGs结构和功能研究及专一性分析检测对特异性探针的迫切需要,也可以为以GAGs为靶点的肿瘤诊断和靶向治疗提供亟需的专一性探针。本论文得到的特异性识别Hep样结构的探针VAR2HP,不仅为Hep的专一性检测提供了新型生物相容性探针,其能够识别的Hep样表位在多种肿瘤细胞中过表达,作为一种新GAGs类靶点,作为血清及肿瘤组织标志物,在相关肿瘤的肿瘤诊断和靶向治疗中具有重要的潜在应用价值。