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缺血/低氧预适应(Ischemic/hypoxic preconditioning，I/HPC)是组织对缺血/低氧刺激产生的一种内源性保护现象，即预先给予轻、中度间断性缺血/低氧刺激，组织或细胞会对随后发生的重度持续性缺血/低氧产生耐受能力。这一现象可发生在脑、心脏、肝、小肠、骨骼肌、肾脏和肺等器官系统。关于参与I/HPC细胞内信号分子机制的研究，已有大量报道。这些细胞信号分子包括：腺苷和腺苷A1或A2受体、ATP—敏感K+通道、一氧化氮合成酶(NOS)等。然而，上述细胞信号分子机制并不能完全解释I/HPC的保护效应。有趣的是，无论上述哪种机制均涉及蛋白激酶C(protein kinases C，PKCs)激活。我们以往研究发现，经典型蛋白激酶CβⅡ、γ(cPKcβⅡ、γ)和新奇型PKCε(nPKCε)的激活均参与了脑HPC的发生发展过程。然而，HPC对小鼠局灶性缺血脑组织是否具有保护作用及其可能机制尚不清楚。据此，本研究拟利用小鼠整体低氧预适应(HPC)模型和小鼠大脑中动脉阻塞(MCAO)缺血模型，应用神经功能评分、TTC染色和NeuN染色等方法探讨HPC是否对继发局灶性缺血具有保护作用。同时，应用蛋白印迹(Western blot)等方法观察HPC预处理对MCAO小鼠皮层组织nPKCε膜转位和蛋白表达水平的影响。应用nPKCε特异性抑制剂εV1—2和PKC激动剂PMA进一步探讨nPKCε是否参与了HPC对MCAO所致缺血性脑损伤的保护作用，从而进一步丰富人们对脑HPC信号转导机制的认识。
实验在室温20-22℃下进行，选用成年(12—14w，18—22g)雄性BALB/c小鼠，动物实验方法按照美国国立卫生研究院(NIH)制定的《实验动物饲养和使用》指南(NIH Publication No.80-23)进行。将实验动物随机分为假手术(S)、单纯缺血(I)、HPC后缺血(HPC+I)，以及HPC+nPKCε抑制剂(εV1—2)+1和PKC非亚型特异性激动剂(PMA)+I等5组。小鼠在HPC处理(低氧暴露4次)后1小时，进行MCAO缺血操作，术后6小时进行神经功能学评分，之后迅速断头取脑。—20℃冷冻20min后进行TTC染色，并进行脑梗死面积、缺血区密度值和水肿率分析。根据TTC染色结果，分离小鼠脑组织皮层缺血核心区(Ic)、半影区(P)及对侧皮层(C)，并抽提上述部位的胞浆，膜相关和膜蛋白组份。应用Western blot等技术方法，观察HPC预处理后，MCAO小鼠大脑皮层组织nPKCε膜转位水平与蛋白表达量变化。同时，应用免疫组织化学方法，观察HPC后小鼠缺血皮层神经元数目变化情况。分别进行侧脑室和腹腔注射εV1—2与PMA，进一步观察nPKCε膜转位水平变化及蛋白表达量变化是否参与了HPC对缺血脑组织的保护作用。实验数据使用单一因素方差分析(One way ANOVA)和Bonferroni检验进行统计学处理，并以均数±标准差(X±S.D.)表示，其中p<0.05为显著性差异。实验结果如下：
1.随着低氧暴露次数增加，小鼠低氧耐受时间逐渐延长
与低氧暴露1次(H1，17.8±0.6min)相比，重复低氧暴露2次(H2，25.4±0.8min)、3次(H3，30.8±0.9min)和4次(H4，35.6±1.3min)组小鼠的低氧耐受时间明显增加(p<0.05，n=50)。提示，在HPC形成过程中，小鼠逐渐对低氧刺激产生耐受。
2.HPC可缓解MCAO致小鼠神经行为学损伤
MCAO术后6小时，对小鼠单项神经行为学变化的分析发现，局部脑缺血可明显损伤其神经行为学的表现，如活动减少、姿势侧倾、拖地步态、低反应性、前肢屈曲、前肢肌力减低和运动失调等，而HPC可缓解上述神经行为学改变。
3.HPC明显减小脑梗死面积、水肿率和梗死区密度值
TTC染色结果显示，假手术组未见梗死灶，全脑呈均匀红色，缺血组大脑皮质及纹状体可见明显梗死区，呈苍白色，其余部分为红色。与单纯缺血组相比，HPC缺血组小鼠脑水肿率(p<0.05，n=12)，脑梗死面积(p<0.05，n=12)及梗死区密度值(p<0.05，n=12)明显下降。
4.HPC可减少缺血核心区神经元的丢失
研究发现，与假手术组相比，缺血6小时后小鼠皮层缺血核心区NeuN阳性细胞数目明显减少，但HPC可显著缓解缺血核心区神经细胞数目丢失(p<0.05，n=6)；在缺血12小时和24小时后，缺血核心区内没有发现NeuN阳性细胞。
5.HPC对缺血鼠脑皮层组织nPKCe膜转位和蛋白表达量的影响
(1) HPC可明显抑制皮层缺血半影区nPKCε膜转位的降低
Western blot结果显示，缺血6小时后单纯缺血组小鼠皮层缺血核心区和半影区内nPKCε膜转位水平与假手术组相比明显下降，而HPC缺血组小鼠皮层半影区内nPKCε膜转位水平与单纯缺血组相比明显增高(p<0.05，n=6)。缺血24小时后研究发现，单纯缺血组小鼠皮层缺血核心区和半影区内nPKCε膜转位水平与假手术组相比显著降低(p<0.05，n=6)，而HPC缺血组小鼠皮层半影区内nPKCε膜转位水平与单纯缺血组相比没有明显变化。提示，HPC可能通过增高nPKCε膜转位水平对小鼠缺血脑组织起保护作用。
(2) HPC不影响皮层缺血核心区和半影区内nPKCε蛋白表达量的降低。研究表明，无论在缺血6小时还是24小时后，与假手术组相比，单纯缺血组小鼠皮层缺血核心区及半影区内nPKCε的蛋白表达水平明显降低(p<0.05，n=6)，而HPC缺血组小鼠皮层缺血核心区及半影区内nPKCe蛋白表达水平与单纯缺血组小鼠相比没有显著变化。提示，HPC可能通过改变nPKCε膜转位水平而非蛋白表达水平对小鼠缺血脑组织起保护作用。
6.nPKCε抑制剂和激动剂对HPC保护作用的影响
侧脑室注射nPKCε特异性抑制剂εV1—2(5nM，5μ1)可明显抑制HPC+I小鼠皮层缺血区和半影区组织内nPKCε膜转位水平的降低(p<0.05，n=6)；TTC染色结果提示，εV1—2可明显增高小鼠脑梗死面积、梗死区密度值和水肿率(p<0.05，n=12)。然而，腹腔注射PKC非亚型特异性激动剂PMA(0.15mg/Kg)明显增高小鼠缺血核心区和半影区nPKCε膜转位水平(p<0.05，n=6)，降低梗死区密度值和水肿率(p<0.05，n=12)的同时，不影响脑梗死面积。提示PKC非亚型特异性激活可部分模拟HPC的神经保护作用。
综上所述，HPC可以明显缓解MCAO致小鼠神经行为学改变和缺血性脑损伤程度，包括脑梗死面积、水肿率和梗死区密度值的降低，以及神经元丢失的缓解。同时，HPC可抑制小鼠缺血皮层半影区内nPKCε膜转位水平的降低；应用nPKCε特异性抑制剂可减弱HPC的神经保护作用，而应用PKC非亚型特异性激动剂PMA可部分模拟HPC的神经保护作用。本研究所获成果丰富了人们对脑HPC信号转导机制的认识，也为临床上开发抗缺血/低氧性脑损伤药物提供了一定的实验依据。