类胡萝卜素作为植物的次生代谢物,参与众多生物学过程,如光合作用、抗氧化作用和激素的合成等;同时,类胡萝卜素也对人类健康起着必不可少的作用,如提供维生素A前体、抗衰老及预防心血管疾病等诸多功能。而这些类胡萝卜素合成并储存于有色体中,因此,研究木薯块根有色体类胡萝卜素含量积累的分子机理研究具有重要意义。本研究以白心木薯华南6068(SC6068)、蛋黄木薯华南9号(SC9)、紫叶黄心木薯(BGM019)和粉红木薯(Mirasol)作为研究材料,深入分析不同生育期木薯块根类胡萝卜素积累的分子机理,主要研究结果如下:1、木薯块根膨大期和成熟期与类胡萝卜素代谢通路相关的14个基因和4种蛋白质表达水平变化。用HPLC检测块根β-胡萝卜素含量的变化,分别用qRT-PCR和Western blot方法对类胡萝卜素代谢通路相关基因和蛋白酶的表达水平进行分析。以华南6068为对照,研究表明:华南9号和紫叶黄心木薯(BGM019)成熟期中的类胡萝卜素合成途径关键基因PSY2、LCY5基因显著高于膨大期,而降解相关的关键基因CCD1、NCED3在成熟期的表达量显著低于膨大期(P<0.05)。粉红木薯(Mirasol)成熟期中PSY2、LCYB的显著下调与CCD1、NCED3的显著上调(P<0.05)是造成β-胡萝卜素含量差异的原因之一。通过分析不同木薯品种(系)在膨大期和成熟期块根类胡萝卜素代谢途径相关基因的表达水平,有助于解析β-胡萝卜素积累的分子机理。此外,Western blot结果显示抗坏血酸过氧化物酶、谷胱甘肽还原酶、超氧化物歧化酶和HSP70虽然和块根类胡萝卜素代谢途径没有直接关联,但它们在木薯膨大期和成熟期块根表达水平有显著差异(P<0.05)。表明活性氧可能参与质体转化。2、外源ABA及钨酸钠能提高块根β-胡萝卜素的含量;其中外源ABA与钨酸钠都提高了类胡萝卜素合成途径基因PSY2与LCYB表达,并抑制降解相关的ZEP与NCED3基因的表达,从而能够在转录水平的变化上解释β-胡萝卜素含量的变化,且LCYB与ZEP在转录与翻译水平具有一致性;与质体相关PAP1基因和FBN1a在处理下上调表达在一定程度上增加了质体小球的数量;外源ABA及钨酸钠使活性氧(ROS)相关的超氧化物歧化酶(Fe-SOD和Cu/Zn-SOD)表达量升高保护了块根中类胡萝卜素的稳定;这三者共同作用,提高了块根β-胡萝卜素的含量。3、以Percoll为梯度分离液,经过不连续梯度离心后,40%-50%Percoll梯度层间为富含有色体层。光学显微镜显示分离的有色体有较好的完整性,属于晶状有色体类型。采用亚细胞器(线粒体)及质体标记性抗体,Western blot分析表明分离出的有色体纯度高。对高类胡萝卜素SC9与低类胡萝卜素SC6068进行有色体差异蛋白质组分析鉴定得到34个蛋白质,其中上调表达17个,下调表达17个。差异蛋白质点涉及4大类代谢途径:碳代谢与能量代谢、抗氧化及解毒、氨基酸代谢、蛋白质生物合成。值得关注的是涉及到碳代谢与能量代谢的相关蛋白质所占比例最高,主要参与类胡萝卜素的合成。STRING代谢网络显示:Enolase 2与elongation factor互作关系最多,是整个互作网络的核心蛋白质。qRT-PCR定量分析显示Enolase2在高类胡萝卜素的蛋黄木薯SC9的表达水平显著高于SC6068。推测其可能是影响SC9与SC6068类胡萝卜素差异的主要蛋白质之一。4、干旱胁迫抑制类胡萝卜素的合成途径上关键基因和酶的正常表达。主要包括干旱胁迫抑制了PSY2、HYD、ZE 基因的正常表达,此外也显著抑制ZEP、LCYB酶与类胡萝卜素储存相关的质体基因(PAP1)和酶(FBNla)的表达。测定了干旱胁迫下SC9块根内源激素的变化,其中ABA、GA3的含量升高而JA、IAA降低。ABA含量的升高与NCED3的表达量上调正相关,而JA含量的降低导致活性氧相关酶的表达量的下调。差异蛋白质组学分析表明,活性氧相关酶和类胡萝卜素合成途径相关酶与块根有色体差异蛋白质的联系组密切相关。干旱胁迫引起了碳代谢与能量代谢、分子伴侣、蛋白质合成、结构类相关蛋白的表达量发生变化。其中,碳代谢与能量代谢相关的Enolase 2与分子伴侣蛋白HSP70-2处于代谢网络的核心位置。Western blot证实热激蛋白HSP70在干旱胁迫下的下调表达与差异蛋白质组学的研究结果相一致。先前验证与类胡萝卜素合成前体物质相关的Enolase 2蛋白在干旱胁迫下的表达量也显著降低。可见干旱胁迫影响了块根内源激素、基因表达的变化、相关酶的表达,三者相互关联进而造成β-胡萝卜素含量的降低。