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丝裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase,MAPK)家族有三个主要成员:p38丝裂原活化蛋白激酶(p38 mitogen-activated protein kinase,p38MAPK),C-Jun N-末端激酶/应激活化蛋白激酶(c-Jun N-terminal Kinases/stress-activated protein kinase,JNK/SAPK)和细胞外信息调节蛋白激酶(extracellular signal-regulated kinase,ERK)。在活化时,MAPK可把一系列的刺激信息从细胞膜传送到核内,影响染色体的结构,改变转录活性,从而对基因转录进行调节。以往的研究已经发现MAPK在炎症因子的活化以及肿瘤细胞的发展、分化、以及凋亡等多个方面发挥重要作用。白藜芦醇以往以其抗炎、抗氧化和对心脏的保护作用为人们所知。近来,一些研究发现白藜芦醇对很多肿瘤有化学预防作用。但有关白藜芦醇对肺癌细胞的生物学效应报道甚少,并且有关白藜芦醇在癌症细胞中的作用机制也并不明确。为了研究MAPK信号通路对肺癌的作用,并对新的肿瘤药物—白藜芦醇的作用机制提供理论依据,我们进行了以下两方面的研究:1)对p38MAPK,JNK,ERK在肺癌中的磷酸化活化用蛋白免疫印迹法进行检测。2)白藜芦醇对A549人类肺腺癌细胞的抗增殖效应用MTT法,流式细胞仪等进行分析,并对MAPK及其下游因子如p53,Bcl-2家族蛋白的表达用蛋白免疫印迹法进行检测,试图探讨白藜芦醇在肺癌细胞中的作用机制。第一部分磷酸化的MAPK在人非小细胞肺癌中的表达情况方法:取2006年8月至11月在浙江大学附属第一医院胸外科行手术治疗的43例非小细胞肺癌的肿瘤组织及其自身作为对照的正常组织。对磷酸化活化的p38MAPK,JNK和ERK的表达情况用蛋白免疫印迹法进行检测。并对p38MAPK和ERK的活化程度与一些临床病理参数(包括性别,年龄,肿块大小,淋巴结转移情况,分化程度,组织类型以及病理分期)的联系进行研究。结果:发现与自身配对的正常肺组织相比,p38MAPK和ERK在肺肿瘤组织中明显活化,而且p38MAPK的活化程度与肿块的大小正相关。第二部分MAPK信号通路在白藜芦醇对A549人类肺腺癌细胞系的抗增殖效应中的作用方法:我们把A549细胞在不同浓度中(0-200μmol/L)的白藜芦醇培养6-72小时,并用MTT法对白藜芦醇的抗增殖效应进行检测。然后用50μmol/L的白藜芦醇对A549细胞处理24小时后,用流式细胞仪进行周期分析并对凋亡细胞进行计数。在依次增加的不同浓度的白藜芦醇(0-100μmol/L)处理后,用免疫印迹法对MAPK的各种磷酸化形式进行了检测。而一些凋亡因子如caspase-3原型(pro-caspase-3),caspase-9的剪切体(cleaved-caspase-9),聚二磷酸腺苷核糖多聚酶(PARP)的剪切体(cleaved-PARP),以及p53,Bcl-2家族也用免疫印迹法进行了定量检测。最后,用SB203580将p38MAPK信号途径阻断,用western—blot法分析阻断后p53,Bcl-2家族蛋白的表达的变化。结果:白藜芦醇对A549人类肺腺癌细胞系的抗增殖作用表现为剂量和时间的双重依赖性。白藜芦醇诱导了细胞周期的S期阻滞并导致肺癌细胞的凋亡。免疫印迹方法发现用白藜芦醇处理A549细胞24小时后caspase-9和PARP的剪切体的表达上升,而caspase-3的原型表达下降,印证了A549细胞的凋亡。同时,我们发现磷酸化的p38MAPK(phospho-p38MAPK)蛋白在A549细胞中的表达在白藜芦醇处理24小时后随药物浓度的增加而上升,与之相对,ERK的表达下调而JNK表达无明显趋势。此外,白藜芦醇的处理也导致p53的活化和Bcl-2家族蛋白中促凋亡因子Bax表达的上调,这种改变有利与凋亡的发生。阻断p38MAPK信号途径后,白藜芦醇诱导p53和Bax活化的效应减弱,相应的对caspase-9和PARP的剪切体以及pro-caspase-3的作用也减弱。结论1.ERK和p38MAPK在非小细胞肺癌组织中被特异性激活了。p38MAPK的活化与肿瘤的大小以及患者的年龄相关。这些结果提示了ERK和p38MAPK可能在肺癌细胞的发生发展中有重要作用。2.白藜芦醇对A549人类肺腺癌细胞的抗增殖作用表现为剂量和时间的双重依赖。白藜芦醇能诱导肺癌细胞的S期阻滞并导致了凋亡。这提示了白藜芦醇作为一个化学预防药物对肺癌进行治疗和预防的可能性。3.白藜芦醇诱导死亡的信号通过caspase-9/caspase-3/PARP途径,caspase-9的剪切需经过线粒体,这也提示了我们白藜芦醇的致凋亡作用至少有部分通过线粒体途径。4.白藜芦醇对A549细胞的凋亡作用也通过了p38MAPK/p53/Bax通路,并对Bcl-2家族蛋白进行调节,Bax/Bcl-2比率增加,这提示了p38MAPK可以成为肺癌治疗的靶点。