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大血藤为大血藤科植物大血藤Sargentodva cuneata (Oliv.)Rehd.et Wils.的干燥藤茎,是中国独有的一种植物,具有清热解毒、理气活血、祛风杀虫、消肿散结、止痛、败毒等功效,临床用以治疗风湿性关节炎、急性阑尾炎、肠痈腹痛、经闭痛经症状等。近年来药理活性研究表明大血藤具有较强的抗炎免疫、抗氧化以及抗菌等作用。本论文研究了乙醇提取物以及各萃取部位的抗炎免疫活性、抗氧化活性,并且采用响应面分析法优化大血藤中总酚超声提取的最佳工艺条件,采用LC-UV/MS法解析活性部位物质基础,为该药材的深入研究提供了科学依据。主要研究内容和结论如下:
1.大血藤各部位抗炎免疫活性及作用机理研究。采用二甲苯致小鼠耳肿胀模型和角叉菜胶致大鼠足肿胀模型研究大血藤各部位抗炎活性及作用机理。发现大血藤各部位剂量依耐性的抑制二甲苯致小鼠耳肿胀,二氯甲烷部位、乙酸乙酯部位和剩余部位在剂量为200mg/kg时,对二甲苯致小鼠耳肿胀有显著的抑制作用,抑制率分别为50.26%,61.78%,69.14%。并且乙酸乙酯部位和剩余部位在给药后1-4h,对角叉菜胶致大鼠足肿胀有显著的抑制作用,能够有效降低角叉菜胶致大鼠肿胀足跖炎症组织中PGE2及MDA的含量,增加体内因炎症诱导而产生的自由基清除剂如SOD,能恢复大鼠血清及肝脏组织中SOD的活力,抑制脂质过氧化产物MDA含量。采用AA大鼠模型研究大血藤各部位抗炎免疫活性及作用机理。发现从致炎d24开始,大血藤乙酸乙酯部位、剩余部位对AA大鼠继发性肿胀有明显的抑制作用,其中剩余部位抑制肿胀的效果优于乙酸乙酯部位组。大血藤乙酸乙酯部位和剩余部位均可不同程度的提高AA大鼠脾淋巴细胞增殖反应和腹腔巨噬细胞吞噬能力,降低IL-1β和TNF-α含量。表明大血藤对大鼠佐剂性关节炎有明显的治疗作用,其作用机制可能与其调节免疫功能有关。
2.大血藤各部位抗氧化活性研究。采用清除DPPH自由基法、还原力测定法、邻二氮菲-Fe3+还原法和总抗氧化性能测定法,考察大血藤各部位体外抗氧化活性。在各体系中,各部位表现的抗氧化活性顺序一致,均为剩余部位>乙酸乙酯部位>乙醇提取物>二氯甲烷部位>石油醚部位。在清除DPPH自由基体系中,剩余部位清除DPPH的IC50为5.53μg/mL,优于Vc对照组(ICs07.10μg/mL),乙酸乙酯部位、乙醇提取物、二氯甲烷部位、石油醚部位的IC50依次为:5.89μg/mL,26.81μg/mL,26.62μg/mL,152.22μg/mL。
3.大血藤各部位总酚含量和主要酚酸类化合物的含量测定。以没食子酸为标准品,采用Folin-Ciocalteu法测定总酚含量。乙醇提取物、石油醚部位、乙酸乙酯部位、二氯甲烷部位和剩余部位的总酚含量依次为:242.8,63.7,238.6,346.8,449.8mg/g。采用HPLC同时测定大血藤各部位绿原酸、咖啡酸、香草酸含量。流动相:A为1%冰醋酸,B为甲醇,以A∶B=68∶32等度洗脱;柱温:30℃;流速:1ml/min;检测波长:327nm;进样量:20μl。绿原酸和咖啡酸在乙酸乙酯部位含量最高,分别为4.52%、0.11%,香草酸在二氯甲烷部位含量最高,为5.8%。
4.大血藤活性部位物质基础研究。首先采用柱色谱和波谱技术分离鉴定大血藤活性部位主要化合物。在乙酸乙酯部位分离得到的单体化合物有:香草酸、原儿茶酸、丁香酸、咖啡酸、阿魏酸、绿原酸、β-谷甾醇和胡萝卜苷,在剩余部位分离得到的单体化合物有:绿原酸和sargentol。采用LC-MS分析方法,结合得到的质谱数据,与文献中已知化合物进行对照解析,初步鉴定了大血藤乙酸乙酯部位中的9个主要酚酸类化合物,分别为新绿原酸,绿原酸,香豆酸-4-O-β-D-吡喃葡萄糖苷,隐绿原酸,原儿茶酸,咖啡酸,3-香豆酰奎宁酸,对香豆酸和阿魏酸,鉴定了剩余部位的6个主要化合物,分别为sargentol,新绿原酸,绿原酸,隐绿原酸,咖啡酸和对香豆酸。该研究初步揭示了大血藤乙酸乙酯部位和剩余部位抗炎免疫和抗氧化的药效物质基础,为大血藤的深入研究及开发利用提供了参考。
5.响应面分析法优化大血藤中总酚的超声提取工艺。根据中心组合(Box-Behnken)实验设计原理,在单因素实验基础上,对乙醇浓度、提取温度、提取时间3个影响显著因素采用三因素三水平的响应面分析法优化大血藤总酚的最佳超声提取条件是:乙醇浓度56%,提取温度62℃,提取时间34min,提取两次。在此条件下,大血藤总酚得率可达10.629%,与理论预测值10.735%的相对误差为-O.99%。