在真核细胞的有丝分裂中,为了确保细胞的命运决定因子准确地分配到每个子细胞,纺锤体必须正确定位。细胞质动力蛋白Dynein在各类细胞的纺锤体定位过程中起着关键作用。为了能在沿微管运动的同时产生定向的拉力来移动纺锤体,Dynein需要被锚定在细胞膜上。在芽殖酵母中,Dynein通过细胞膜上的蛋白Num1与细胞膜连接。Num1也是迄今为止所发现的参与纺锤体定位的唯一位于细胞膜上的因子。它由多个结构域组成,接近C末端的PH结构域介导与细胞膜的结合,而位于N末端的PA结构域则通过自身相互作用介导Num1在细胞膜上形成多分子复合物,并介导Num1与Dynein的相互作用。此外,除了在纺锤体定位中的作用,Num1还介导酵母细胞内线粒体与细胞膜的连接。但是,目前尚不明确这些过程中Num1的活性如何调节。本研究从两个方面着手研究Num1:1)分析Num1的磷酸化;2)通过分离PA结构域的互作蛋白鉴定Num1的调节蛋白。序列分析结果显示Num1序列中存在一系列潜在的磷酸化位点,尤其是位于其C末端的一段序列。我们用Phos-tag SDS-PAGE技术分析了包含C末端序列及PA和PH结构域的MMNum1的磷酸化。Myc或GFP标记的MMNum1蛋白在phos-tag SDS-PAGE中呈多条带迁移,说明可能发生了磷酸化修饰。而且,蛋白磷酸酶处理消除了其中迁移慢的条带,进一步证实MMNum1存在磷酸化。此外,去除MMNum1的C末端序列使得磷酸化条带的积累明显变少,由此推断C末端的氨基酸参与了MMNum1蛋白的磷酸化。在Num1的互作蛋白鉴定实验中,我们在大肠杆菌细胞中表达并制备了PA结构域的重组蛋白用于Pull-down实验,结合质谱分析,成功鉴定出一系列重要的新的Num1的互作蛋白。按照功能可以分为以下几类:1)核糖体蛋白;2)在细胞周期中调节蛋白降解的后期促进复合物(APC)的亚基;3)与细胞膜相连的Eisosome复合物的成员;4)参与蛋白折叠、分配及转运的内质网和高尔基复合体蛋白;5)参与基因转录、翻译的核酸酶和蛋白酶;6)其他一些功能各异的蛋白。磷酸化的确立和互作蛋白的鉴定为我们进一步揭示Num1在纺锤体定位及线粒体中的作用机制奠定了良好的基础。