论文部分内容阅读
流感病毒(Influenza virus)是引起流行性感冒的主要病原。在流感的季节性流行中,人群流感病毒感染率可达15-20%。预计全球每年有超过500,000人死于流感的季节性流行及其并发症。而流感的大流行范围更广,危害更重。在人类历史上几次流感的大流行不仅使数千万人丧生,也给世界各地带来了巨大的经济损失。近年来各地高致病性禽流感疫情以及当前H1N1甲型流感病毒的流行趋势,再次突显了流感病毒研究的重要性和迫切性。鉴于目前多种流感病毒检测方法的局限性,以及当前流感病毒药物筛选、RNAi筛选等高通量研究方法在流感病毒研究中应用时对简便、快速、特异的基于细胞的流感病毒检测方法的迫切需要,本课题在293T和A549细胞中建立了一个基于报告基因的甲型流感病毒特异的定量检测实验平台。所使用的流感病毒定量检测报告质粒pHH21-Luc,可以在真核细胞聚合酶Ⅰ启动子下转录出一段单链核酸,这段核酸的结构与流感病毒第五节段很相似,只是用报告基因代替了流感病毒NP蛋白。我们应用pHH21-Luc质粒,首次在293T细胞和A549细胞中成功建立甲型流感病毒PR/8/34株定量检测体系,通过不同PFUs接毒,确定了该体系的线性范围。在这个线性范围内,报告基因荧光素酶的表达可以反映流感病毒的复制情况。为了更直观的在荧光显微镜下观察流感病毒复制水平,我们将pHH21-Luc进行了改造,将报告基因由荧光素酶换成了绿色荧光蛋白EGFP,并命名为pHH21-EGFP。我们同样用pHH21-EGFP在293T细胞和A549细胞中建立了甲型流感病毒PR/8/34株定量检测体系,并确定线性范围。应用该流感病毒检测体系,很好的显示了抗流感病毒药物盐酸金刚烷胺的抗流感病毒作用,提示它在抗流感高通量药物筛选方面的潜在应用价值。应用此系统,我们发现mTOR(mammalian Target of Rapamycin)抑制剂Rapamycin具有抑制流感病毒复制的作用,提示mTOR可能参与了流感病毒的复制过程。我们利用靶向EGFP基因的特异siRNA表达质粒在293T细胞进行的RNA干扰实验基本证明该流感病毒的定量检测系统与RNAi的兼容性,为我实验室进行影响流感病毒复制的宿主基因的规模化RNAi筛选研究奠定了基础。此基于报告基因的甲型流感病毒定量检测体系将是在细胞体系中进行高通量流感病毒药物筛选及致病机理研究的有力工具。