目的:咳嗽变异性哮喘是慢性咳嗽最常见的原因,可归属于中医“风咳”范畴。本研究通过古今文献梳理,探讨古今风咳理论及辨治特点;从网络方剂学的角度阐释三拗汤加全蝎、僵蚕及拆方干预咳嗽变异性哮喘的网络调控机制特点;通过体内、体外实验研究,探讨三拗汤加全蝎、僵蚕及拆方干预咳嗽变异性哮喘的效应与机制特点。方法:1.收集整理古今风咳相关文献,梳理古今风咳的理论源流、病因病机及治法特点。2.基于网络方剂学的研究策略,使用开源数据库、在线分析平台、已发表文献等资源,检索、整理三拗汤加全蝎、僵蚕(全方)及拆方(三拗汤、僵蚕-全蝎)干预咳嗽变异性哮喘(CVA)的潜在靶点信息,分别对潜在靶点进行GO富集分析、KEGG通路富集分析、PPI网络构建及拓扑参数分析等,阐述全方干预CVA的网络调控机制特点,并比较拆方干预CVA的网络机制特点与差异。3.采用OVA致敏、激发建立CVA小鼠模型,使用辣椒素吸入法检测小鼠5 min内咳嗽次数,检测外周血嗜酸性粒细胞(EOS)计数、肺泡灌洗液中白细胞总数,全身体积描计系统(WBP)检测气道高反应性改变,HE染色法观察肺组织病理改变,ELISA法测定肺泡灌洗液中细胞因子(IL-4、IL-13)、神经生长因子(NGF)、降钙素基因相关肽(CGRP)及前列腺素E2(PGE2)水平变化,qPCR法检测肺组织和延脑组织中TRPA1、TRPV1、TRPV5基因表达,以及Western blot法测定肺组织和延脑组织中TRPA1、TRPV1、TRPV5蛋白表达,探讨三拗汤加全蝎、僵蚕干预CVA的效应机制,以及拆方配伍干预CVA的效应机制特点与差异。4.建立二氧化硫衍生物致人支气管上皮细胞(16HBE)炎症损伤模型,使用MTT法筛选各药物细胞毒性及三拗汤加全蝎、僵蚕对细胞存活率的影响,流式细胞术检测细胞活性氧自由基水平的改变,qPCR法检测细胞TRPV1、TRPV5基因表达等。探讨三拗汤加全蝎、僵蚕对二氧化硫衍生物致16HBE细胞炎症损伤的保护作用机制。结果:1.咳嗽变异性哮喘可归属于中医风咳范畴。古代风咳含义较广,在历代的演变中还被描述为风嗽、伤风嗽、伤风咳嗽、因风咳嗽、感风咳嗽、冒风咳嗽等。风咳按发病原因可分为外感和内伤,主要致病因素包括风寒、风热、风燥、痰盛、火郁、气虚、血虚、劳倦、情志等。外感风咳多属风寒、风热为患,可通过辛散解表、宣肺止咳,清金化痰、降气止咳等法治疗,内伤风咳多因风痰内蕴、肝风内动、脏腑内伤而致,可通过祛风化痰、熄风止痉、佐金平木、培本固元等法治疗。现代医家将临床上表现为急迫性、阵发性、挛急性、刺激性等特征的咳嗽归属于风咳范畴,临床发病特点为干咳无痰或少痰,常伴有咽喉发痒的症状,可由冷空气、油烟、灰尘等因素诱发及加重,见于咳嗽变异性哮喘、嗜酸性粒细胞支气管炎、变应性咳嗽、感染后咳嗽等疾病。主要病因病机包括风邪犯肺、风痰伏肺、肝风内动、肺气虚损等,治法有疏风宣肺、解痉止咳、化痰通络、祛风平肝、滋阴理肺、补肺固表等。在此基础上,还可根据患者体质、年龄、疾病发展情况等,进行分期治疗。发作期以祛邪为主,注重疏风宣肺、缓急解痉、化痰通络、润肺止咳、利咽等;缓解期强调补肺益气、扶正固表等防止复发。此外,古代医家有使用虫类药治疗伤风咳嗽、风痰喘嗽的记载,现代医家善用虫类药治疗持续性、痉挛性等具有风咳特征的咳嗽,以增强搜风通络、解痉止咳之功。2.通过靶点整理,共获得CVA相关疾病靶点2082个;三拗汤加全蝎、僵蚕药物活性成分530个,共作用于1873个与人类相关的靶点基因。其中:(1)三拗汤加全蝎、僵蚕与CVA疾病作用的交集靶点共 108个,包括SCN5A、MAPK、CYP3A4、TNF、TRPV1、EGFR、IL1β、IL-6等,主要涉及槲皮苷、乌索酸、山奈酚、柚皮素、卵孢白僵菌素、甘氨酸、白僵菌素、芒柄花素、甘草酸等成分;主要涉及细胞对刺激的反应,参与转录调节、抗氧化、信号受体结合等多种分子功能,并作用于IL-17信号通路,MAPK、TNF、血管内皮生长因子、神经营养因子、炎症介质对TRP通道的调节等通路。(2)三拗汤(拆方一)与CVA作用的交集靶点共84个,僵蚕-全蝎(拆方二)与CVA作用的交集靶点有57个,两者干预CVA既有共同作用靶点,也有其特有作用靶点。进一步分析得知:三拗汤干预CVA主要涉及细胞对化学刺激及含氧化合物的反应,参与细胞因子受体结合、细胞因子活性等功能,主要作用于IL-17、HIF-1、TNF等信号通路以及Th17细胞分化、细胞因子受体相互作用等;僵蚕-全蝎干预CVA主要涉及血管调节作用、酶活性调节等,主要作用于钙信号通路、神经活性配体-受体相互作用、血管内皮生长因子信号通路等。3.实验结果发现,三拗汤加全蝎、僵蚕可显著减少模型小鼠5 min内辣椒素引咳次数(P<0.05,P<0.01)、外周血EOS数量(P<0.01)、肺泡灌洗液中白细胞总数(P<0.01),降低气道高反应性(P<0.05,P<0.01),并可显著改善肺组织病理变化,其作用机制涉及降低细胞因子(IL-4、IL-13)水平(P<0.05,P<0.01)、神经肽类物质(NGF、CGRP)水平(P<0.05,P<0.01),及神经源性炎症介质PGE2水平(P<0.05,P<0.01),并下调肺与延脑组织中TRPA1、TRPV1、TRPV5基因与蛋白表达(P<0.05,P<0.01),以及增加16HBE细胞存活率(P<0.05),减少细胞活性氧自由基水平(P<0.05),减少细胞中TRPV1、TRPV5基因的表达(P<0.05)。此外,三拗汤加全蝎-僵蚕组:小鼠咳嗽次数明显低于三拗汤组(P<0.05)、EOS计数及白细胞总数均明显低于僵蚕-全蝎组(P<0.05,P<0.01)、气道高反应性低于三拗汤组和僵蚕-全蝎组(P<0.05,P<0.01)、IL-13水平低于僵蚕-全蝎组(P<0.01)、TRPA1基因表达量低于僵蚕-全蝎组(P<0.05)、TRPV1基因与蛋白表达量均低于僵蚕-全蝎组(P<0.05)、TRPV5基因与蛋白均低于三拗汤组(P<0.05,P<0.01);三拗汤组EOS计数与白细胞总数均显著低于僵蚕-全蝎组(P<0.05);僵蚕-全蝎组PGE2水平明显低于三拗汤组(P<0.05)。结论:1.古代风咳理论较为丰富,既包括风寒、风热等外感咳嗽,也包括风痰内蕴、肝风内动、脏腑内伤等内伤咳嗽;治法包括辛散解表、清金化痰、宣肺止咳、祛风化痰、熄风止痉、佐金平木、培本固元等。现代医家认为咳嗽变异性哮喘可归属于中医风咳范畴,主要由风邪犯肺、风痰伏肺、肝风内动、肺气虚损等所致,主要通过疏风宣肺、解痉止咳、化痰通络、祛风平肝、滋阴理肺、补肺固表等法治疗。2.三拗汤加全蝎、僵蚕干预CVA的潜在靶点涉及免疫调节、神经系统、炎症调节、氧化反应、TRP离子通道调控等作用机制。拆方干预CVA的网络机制特点各有偏重,其中三拗汤偏重于细胞对外刺激的反应,主要涉及免疫调节、炎症反应等;僵蚕-全蝎着重参于细胞内的改变,主要作用于代谢酶的调节、血管调节、钙信号通路等。3.三拗汤加全蝎、僵蚕可显著减少CVA模型小鼠的咳嗽次数、外周血EOS数量及肺泡灌洗液中白细胞总数,降低气道高反应性,改善肺组织病理改变,其功效机制涉及免疫细胞因子IL-4、IL-13,神经肽NGF、CGRP,与神经源性炎症介质PGE2的调节,肺与脑组织中TRPA1、TRPV1、TRPV5离子通道的调控,以及对16HBE细胞炎症损伤的保护作用等。通过拆方分析得知,全方效果总体而言优于拆方,而拆方间作用特点各有偏重,其中三拗汤主要贡献在于改善气道炎症、调节肺与延脑中TRPA1、TRPV1离子通道作用,而僵蚕-全蝎在减少咳嗽次数、改善神经源性炎症、及调节肺和延脑中TRPV5离子通道作用上效果突出。