酿酒高粱SbGA2o3基因的TILLING筛选及抗旱性分析

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高粱是一种重要的具有多种用途的作物,如作为人类的粮食、动物饲料、生物能源和酿酒原料。其具有抗旱、耐盐碱、耐涝、耐高温等优良的抗逆性。近年来,酿造高粱育种存在遗传基础狭窄,资源贫乏,植株主要性状有待改良,抗性育种有待加强等问题。创造有价值的育种材料是克服育种问题的手段之一。本研究以茅台专用酿酒高粱品种‘红缨子’为材料,用浓度为0.5%的EMS处理种子,将处理过的种子种植在实验场,形成突变群体,构建突变体库。观察、测定农艺性状,采集叶片,提取DNA,进行赤霉素二型氧化酶基因SbGA2o3的PCR扩增及测序,进而筛选出该基因的突变体及突变位点。对M3代株系及SbGA2o3突变体株系进行抗旱性鉴定。本研究取得如下结果:(1)本研究共获得M1代单株1207份,M2代单株994份,M3代单株415份。在整个生育期内共观察到株型、叶部、穗部、颖壳、生育期、育性及株高7种主要的变异类型。各世代植株分蘖性的变异频率分别是20.5%,7.1%,2.2%;植株的分枝性的变异频率分别是40.4%,13.4%,10.8%;植株叶部的变异频率分别是5.38%,4.4%,4.5%;植株穗型的变异频率分别是81.4%,84.0%,54.7%;穗形的变异频率分别是80.8%,87.7%,47.2%;植株生育期的变异频率分别是17.6%,27.5%,23.9%;植株育性的变异频率分别是85.0%,42.8%,16.1%;植株株高的变异频率分别是91.1%,33.7%,37.4%。(2)测定M3代植株脯氨酸、可溶性糖、丙二醛的含量这三个抗旱生理指标,结合植株田间抗旱形态观察和农艺性状,结果显示:株系3453和3460的脯氨酸含量是对照的7.6和11.3倍,极显著地高于对照;株系3453和3460的可溶性糖含量是对照的4.5和4.3倍,极显著地高于对照;株系3453和3460的丙二醛含量是对照的0.1和0.3倍,极显著地低于对照。两株系的田间抗旱指数均为2级。M3代群体植株中,株系3453和3460的抗旱性较好。(3)对高粱SbGA2o3基因的生物信息学进行分析,结果显示:高粱的SbGA2o3基因编码330个氨基酸,蛋白质分子量为35354.30,等电点为7.66,不稳定指数为36.17,高粱SbGA2o3基因编码的蛋白属于稳定蛋白;包含一个20G-Fe(II)-Oxy保守结构域;该蛋白质的氨基酸序列与玉米(NP_001348171.1)的氨基酸序列高度同源。(4)对突变体库中3000余份DNA进行SbGA2o3基因PCR扩增测序并进行TILLING分析,检测结果显示:共62份单株发生40个等位变异的72个单点突变。在62份点突变单株中,因碱基的缺失和错配导致氨基酸发生了10个错义突变和52个沉默突变,突变密度为1/49.7 bp;11份单株发生多个等位变异的多个点突变,多个位点的突变则导致了氨基酸全突变为错义突变,突变密度为1/54.2 bp。(5)测定SbGA2o3基因突变体植株脯氨酸、可溶性糖、丙二醛的含量这三个抗旱生理指标,结合植株田间抗旱形态观察和农艺性状,结果显示:株系363可溶性糖含量是对照的1.32倍但差异不明显;株系610-2的可溶性糖含量与对照相同。株系363脯氨酸含量是对照的0.55倍,显著地低于对照;株系610-2脯氨酸含量是对照的0.65倍,含量低于对照但差异不显著。株系363丙二醛的含量是对照的0.65倍,极显著低于对照;株系610-2的丙二醛含量是对照的0.98倍,但差异不显著。株系363的田间抗旱指数为2级而株系610-2的田间抗旱指数为4级。SbGA2o3基因突变体植株中株系363的抗旱能力较强,株系610-2的抗旱能力较弱。(6)通过对SbGA2o3基因突变体苗期在PEG模拟干旱下基因的相对表达量分析,结果显示:株系3614和3425的SbGA2o3基因相对表达量极显著地高于对照,分别是对照的12.051和5.980倍;株系3427、1014、1046、1239、3510、1017、610-2、3340、3540的SbGA2o3基因相对表达量极显著地低于对照,分别是0.003、0.147、0.425、0.590、0.340、0.143、0.006、0.107、0.366倍;株系3408的基因表达量是对照的1.111倍,基因表达量高于对照但差异不显著。株系3614的田间抗旱指数为2级,株系610-2的田间抗旱指数为5级,结合抗旱形态观察性分析,株系3614的抗旱能力因突变增强,株系610-2的抗旱能力因突变而变弱。(7)通过对SbGA2o3基因突变体苗期在PEG模拟干旱下基因的相对表达量和处理前后赤霉素含量变化的分析,结果显示:株系3448的SbGA2o3基因的相对表达量极显著地高于对照,其表达量是对照的4.322倍。株系3582的SbGA2o3基因的相对表达量极显著地低于对照,其表达量是对照的0.384倍。株系3448的GA1含量处理后显著低于处理前,是处理前的0.258倍;株系3582的GA1含量处理后极显著低于处理前,是处理前的0.156倍。株系3448、3582处理后的GA4含量分别是处理前0.413、0.368倍;株系3448和株系3582处理后GA8的含量分别是处理前的1.509、0.620倍,差异不显著;株系3448和3582处理后GA34的含量分别是处理前的1.241、0.752倍,差异不显著。株系3448因SbGA2o3基因过量表达使有活性的赤霉素GA1和GA4转变为无活性的GA8和GA34,增强植株的抗旱能力。株系3582的SbGA2o3基因表达量降低,有活性的赤霉素含量减少但无活性的赤霉素含量无增加,并且植株的抗旱能力因SbGA2o3基因突变而降低。本研究共获得M1代单株1207份,M2代单株994份,M3代单株415份。在整个生育期内共观察到株型、叶部、穗部、颖壳、生育期、育性及株高7种主要的变异类型;对M3代群体植株进行抗旱性鉴定分析,株系3453和3460的抗旱性较好;对高粱SbGA2o3基因进行生物信息学分析,该基因编码的蛋白属于亲水性稳定蛋白且氨基酸序列与玉米的氨基酸序列高度同源;对SbGA2o3基因进行TILLING分析,单点突变密度为1/49.7 bp,多位点突变密度为1/54.2 bp;对SbGA2o3基因突变体植株进行抗旱性鉴定分析,株系363因基因突变而抗旱能力变强,但株系610-2因突变抗旱能力变弱;对SbGA2o3基因突变体苗期在PEG模拟干旱下基因的相对表达量和赤霉素含量变化进行分析,SbGA2o3基因的相对表达量变高则有活性的赤霉素GA1和GA4的含量降低且无活性的赤霉素GA8和GA34的含量升高,株系3614和3448因基因突变而抗旱能力变强,株系610-2和3582因基因突变而抗旱能力变弱。
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